FastDNA SPIN Kit for Soil-实验步骤详细解说

一、样品和试剂：

1.已经准备好的新鲜土壤样品

2.试剂盒中的SEWS-M按要求加入100mL乙醇后使用

3. Matrix溶液需要在65-75℃下加热，混匀。

二、使用的仪器和材料：

超净台、离心机等等。全程在超净台中操作，实验服和手套配套齐全。

友情提醒：关于样品的处理和准备此处不作说明。

以下是此实验材料所附的说明书中protocol部分的翻译，并且标注了一些实验的注意事项。

如果有其他需求可以留言~❀

5. Protocol 流程（中英双语）

1.Add up to 500 mg of soil sample to aLysing Matrix E tube. Note: See section 3.2 for important guidelines.

添加500毫克的土壤样品到一个Lysing Matrix E tube。注:重要指南见第3.2节。

注意：1、管子很小，口窄，下一步需要加入试剂，所以不要让土样堵塞管口以免液体不易进入。

            2、多个样品需要写标签，油性笔写的标签容易被过程中沾染的有机溶剂溶解，记得及时补标签，以免搞混。

2.Add 978μL SodiumPhosphate Buffer to sample in Lysing Matrix E tube. Vortex 10-15 seconds.

在上述的Lysing Matrix E tube中，向样品中加入978 μL Sodium Phosphate Buffer（磷酸钠缓冲溶液）。涡旋10-15秒。

注意：用移液枪操作，枪头不要碰到土样！若碰到土样，记得换枪头、补土样。

3.Add 122μL MT Buffer.Shake vigorously to mix, then vortex 10-15 seconds.

添加122μL MT Buffer。大力摇匀，然后涡旋10-15秒。

4.Homogenize in the FastPrep Instrumentfor 40 seconds at a speed setting of 6.0.

在FastPrep仪器中均质40秒，速度设置为6.0。

注意：没有FastPrep设备的话，可以用涡旋代替，但应该大幅延长涡旋时间，比如每个样品涡旋5mins-10min，以保证破碎效果更好。

5. Centrifuge at 14,000 x g for 5-10minutes. NOTE: Extending centrifugation to 15 minutes can enhance eliminationof excessive debris from large samples, or from cells with complex cell walls.

14000 x g离心5-10分钟。注意:将离心时间延长至15分钟可以增强对大样本或复杂细胞壁细胞中过量碎片的清除。

注：1、注意使用离心机之前要配平，配平之后要再次确认，对角线样品的质量应该保持小数点后第二位相同，比如1.223g&1.228g。不同的离心机要求不同，以自己的设备为准。

       2、在等待离心的时间里可以写下一步所要用到的microcentrifuge tube的标签。

6. Transfer supernatant to a clean 2.0 mL microcentrifuge tube. Add 250 μL PPS ( ProteinPrecipitation Solution ) and mix by shaking the tube by hand 10 times , thenincubate at room temperature for 10 minutes . Do not vortex!

将上清液转移到干净的2.0 ml microcentrifuge tube中。加入250 μL PPS溶液，用手摇管10次，然后室温孵育10分钟。不要涡旋!

注意：用合适的移液枪或者注射器转移上清液，记得换枪头~下一步需要继续使用上清液，所以在不过分扰动底层沉淀物的前提下，尽可能多地转移全部上清液。

7. Centrifuge at 14,000 x g for 5 minutesto pellet precipitate. Transfer supernatant (600-800μL) to a clean 2.0 mlmicrocentrifuge tube. Add an equal amount of Binding Matrix to themicrocentrifuge tube. Shake gently by hand to mix, then place on a rocker orinvert by hand for 3-5 minutes to allow binding of DNA to matrix.

14000转速下离心5分钟，使颗粒沉淀。将上清液(600-800μL)转移到干净的2.0 ml microcentrifuge tube中。在microcentrifuge tube中加入等量的Binding Matrix（意思是加入和microcentrifuge tube中的上清液相同的量）。用手轻轻摇动混合，然后放在摇杆上或用手倒转3-5分钟，让DNA与基质结合。

注意：Matrix溶液需要在65-75℃下加热，摇匀之后使用。Matrix：基质。

8.Mix the solution by pipetting upand down several times.Transfer 800μL of solution to a SPINT М Filtertube.Centrifuge at 14,000x g for 5minuets. Empty catch tube. Repeatmixing, transferring and centrifuging for the remaining solution to the sameSPINT М filter tube. discard the flow-through.

上下吸液几次，混合溶液（意思是用移液枪吸、放几次液体，混合溶液）。将800μL溶液转移到SPINT М Filter tube中。14000 x g离心5分钟。清空catch tube（将离心出来的液体清空）。重复混合，转移和离心剩余溶液到同一SPINT М filter tube。仍然丢弃catch tube里的液体。

注意：这里的重复混合，转移和离心意思是将刚刚剩余的，没有转移完的混合液（上清液和Binding Matrix的混合液），用枪头混合、转移、离心。不要搞错操作对象。

9. Add 500μL prepared SEWS-M to the SPINT МFilter tube. Shake gently by hand or flick the tube to mix.

将500μL准备好的SEWS-M（要提前加乙醇）添加到SPINT М Filter tube中。用手轻轻摇动或轻弹管子以混合。

注意：不想用手指可以用笔杆弹，很快乐呢。

10.Centrifuge at 14,000xg for 5 minute.Empty the catch tube and centrifuge again for 5 minutes to remove the residualethanol.

14000 x g离心5分钟。清空catch tube，再次离心5分钟，以除去残余的乙醇。

注意：等待时可以准备下面所需的55℃水浴。

11.Transfer the SPINT М Filter to a clean2.0 mL catch tube. Air dry the SPINT М Filter fo 5 minutes at room temperature.

转移SPINT МFilter到一个干净的2.0毫升catch tube。SPINT М Filter在室温下风干5分钟。

注意：这里需要换一个新的catch tube，将滤芯部分放到新的catch tube中。在超净台里，开盖，室温风干五分钟。等待时准备下一步所需的55℃水浴，节省时间。

12.Add 100μL DES to the SPINT М Filter tubeand gently resuspend the pellet by finger flicking.

 NOTE: Yields may be increased by incubationfor 5 minutes at 55℃in a heat block or water bath.

将100μL DES添加到SPINT М Filter tube中，用手指轻弹使剩余的固体部分重新悬浮。

提示：产量可通过在55摄氏度的热锅或水浴中孵育5分钟来提高。

注意：最好进行孵育，效果更好。

13.Centrifuge at 14,000 x g for 2 minute to elute the DNA into the catch tube.

Discard the SPIN filter. DNA is now ready for PCR and other downstream applications.

Store at -20℃ for extended periods or 4℃ until use.

14000 x g离心2分钟，将DNA洗脱到catch tube。丢弃SPIN filter部分。DNA现在可以用于PCR和其他用途 。在-20℃下长时间保存或在4℃下保存直至使用。

说明：

1.本人水平有限，本文仅供参考。文中若有错误，敬请指正。

2.此实验根据实验室条件不同，细节处或有不同。欢迎友好讨论~