这篇笔记是记录CUT&RUN实验的具体步骤。因为下周就要做CUT&RUN了，首先就要先熟悉一下实验步骤。虽然有纸质版的protocol，但是老板推荐我去试剂盒官网看一下视频，可以更清晰的了解一下原理和步骤，以及注意事项。官网视频：https://www.epicypher.com/resources/protocols/cutana-cut-and-run-protocol/

（一）概述与实验设计

Concanavalin A或者说是ConA beads被lectin（凝集素）包裹，这个beads可以结合细胞膜/细胞核上的glycoconjugates（糖复合物）。膜是通透的，染色质可以被特异的抗体结合，在我们的这个例子里，选择的是PTMs。下一步，加入AG蛋白-micrococcal核酸酶（也叫做pAG-MNase），这个pAG-MNase结合到抗体连接的染色质上，然后通过适量浓度的Ca2+来激活pAG-MNase，从而切割DNA。被切下来的DNA游离到上清里，通过离心我们可以把这些抗体结合的DNA分离出来。

之后提取DNA，制备文库，然后进行测序。

最后就可以进行数据分析了。

（二）注意事项

CUT&RUN实验可以用来分析多种蛋白的染色质图谱，包括PTMs，转录因子，染色质remodelers和染色质writers/readers。

如果你是第一次使用这个技术，请全面考虑你的细胞类型、实验条件、对照、抗体，从而解决你的生物学问题。这个试剂盒可以兼顾多种细胞类型（我现在的实验室里用的就是这个试剂盒）。

对于未固定的细胞，是研究组蛋白PTMs和转录因子理想的实验材料。这种细胞可以有多种来源，包括贴壁、悬浮细胞，组织样品。

CUT&RUN也可以用lightly-crosslinked细胞（翻译成轻微固定的细胞？），样品固定一般用于研究一些染色质瞬时作用因子和某些PTMs。

当然你也可以提取nuclei，这种方法用于研究那些量很少的PTMs和蛋白。另外，当你的实验材料是免疫细胞时，也推荐提取nuclei，因为ConA beads可以激活某些免疫细胞。还有要提一下的是所有的材料都可以低温储存。

细胞数量上，推荐每个样品50万细胞。当然你需要尝试不同的细胞数量来优化你的实验。对于这个试剂盒来说，最少你可以用5000个细胞来进行实验。

对照和标准化是整个实验的关键步骤。阳性对照推荐使用H3K4me3或者H3K27me3,；阴性对照推荐使用Rabbit IgG。你还可以使用spike-in来进行标准化。

CUT&RUN有6种主要试剂。这里需要注意的是，根据你的实验材料是细胞、nuclei、或者固定的细胞，所使用的试剂是不一样的（这里试剂列表就不贴了，有需要的同学可以去试剂盒官网看具体细节）。另外，有些试剂是需要现用现配的，官网说明书里写的很详细。

（三）实验步骤

（1）第一部分：beads活化

beads的活化在1.5ml tube里进行，你还需要与之匹配的magnetic rack。尽量不要用8连管，那样会损失很多。活化buffer要放置在冰上。

首先震荡beads（设置6档或7档），然后快速离心一下。然后把beads放在magnetic上，待溶液澄清了，吸走上清。然后用活化buffer清洗beads 30秒（清洗两次）。最后清洗完，还是用活化buffer重悬beads。这里要注意，beads要放置在冰上。下面是第一部分的总结图：

（2）第二部分：将beads结合到细胞上

这一部分用的wash buffer请放置室温，防止刺激到你的细胞。这一步如果用8连管，每一管的细胞应在4.4milion。你可以首先收集你的细胞，同样是用wash buffer清洗细胞两次，最后用wash buffer重悬你的细胞。之后把beads加入到细胞悬液里。轻微震荡或用移液枪吹打。室温静置10分钟。

下面是第二部分的总结：

（3）第三部分：抗体结合

上一步静置后，把beads放在magnetic上，移除上清。加入冷的抗体buffer，这一步要快，防止beads干燥，但是不要太剧烈，防止细胞裂解。然后加抗体，阴性对照抗体1:10添加，阳性对照抗体1:100添加。轻微震荡，放在摇床上孵育过夜（4度，16小时）。下面是第三部分的总结：

首先快速离心8连管，把管放在magnetic上。待溶液澄清，移除上清。加入冷的dinitonin buffer。清洗2遍。清洗后用dinitonin buffer重悬beads。

（4）第四部分：结合pAG-MNase

pAG-MNase和digitonin buffer应放置在冰上。在样品里加入pAG-Mnase，室温孵育10分钟，快速离心，放置magnetic上，移除上清。使用digitonin buffer清洗beads两遍。然后用digitonin buffer重悬beads。

（5）第五部分：切割DNA

把样品放在冰上，加入CaCl2，这一步很关键，因为Ca会活化pAG-MNase，轻微震荡后，摇床上4度孵育2小时。之后加入stop buffer。如果你想加入spike-in，那么加完stop buffer后可以加入spike-in DNA。

37度10分钟。之后把tube放在magnetic上，把上清液移到新的管里。之后使用DNA purification kit。

（6）第六部分：DNA洗脱到测序

上一步纯化DNA后，推荐10ul体积洗脱。使用1ul进行Qubit检测浓度。一般来说，如果每个样品的细胞数约0.5个million的话，下面有一些浓度参考：

下面就是制备文库了。就是跑PCR。这里要注意的是，如果你要研究的是转录因子，那么你要优化你的PCR条件，因为转录因子的文库片段小于120bp。然后使用bioanalyzer来检测片段富集：

最后就是测序了。一般每个样品3-5个million就可以了。

（四）实验可选步骤

（1）nuclei提取

上面已经提到了，如果你的细胞是免疫细胞，要提前提取nuclei，因为ConA beads上的lectin在结合细胞的时候，会对免疫细胞有影响。pAG-MNase会通过核孔进入到核中。需要注意的是，digitonin buffer浓度要保持0.01%，防止beads粘附到tube上。

（2）交联细胞或nuclei

需要注意的是，我们平时做ChIP-seq的交联方法是不适用于CUT&RUN的。这里使用的是lightly crosslinking。

（3）冻存和贴壁细胞的处理

这里要注意的是，冻存细胞是90%培养基+10%DMSO中放置在-80度里保存的。不要用液氮快速冷冻你的样品，因为会使你的细胞裂解、染色质外漏，会导致你的背景信号非常高。在进行CUT&RUN步骤之前，37度快速解冻细胞。

对于贴壁细胞，不要用胰酶消化细胞！！！因为细胞表面的glycoprotein要结合beads。所以贴壁细胞只能用“刮”的。