Sci Adv | CRISPR工程细胞植入体内释放药物应对炎症

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圣路易斯华盛顿大学医学院的研究人员利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术设计了诱导多能干细胞（iPSCs），可将其植入皮下，以释放抗细胞因子生物药物，以应对类风湿性关节炎引起的炎症。当植入类风湿性关节炎小鼠模型时，工程细胞会自动感应并对炎性细胞因子作出反应，产生治疗水平的药物，从而减少炎症并防止骨侵蚀。

“医生通常通过注射或输注抗炎生物药物来治疗类风湿性关节炎患者，但这些药物在给药时间足够长且剂量足够高以产生有益效果时，可能会引起严重的副作用。”Mildred B. Simon骨外科教授、高级研究员Farshid Guilak博士说，“我们使用CRISPR技术对干细胞中的基因进行重新编程。然后我们通过在编织支架上接种细胞来制作一个小的软骨植入物，并将它们放置在小鼠的皮肤下。这种方法可以让这些细胞在体内停留很长时间，并在炎症发作时分泌药物。”

Guilak及其同事在《Science Advances》上的一篇题为“A genome-engineered bioartificial implant for autoregulated anticytokine drug delivery”的论文中报告了他们的研究。

作者写道，改善疾病的抗风湿生物药物已经彻底改变了自身免疫性疾病的治疗，但大约40%的类风湿性关节炎（RA）患者（一种影响美国约130万成年人的疾病）未能对治疗产生反应。“此外，抗风湿生物药物会抑制免疫系统，使患者容易产生严重的不良反应（AE），例如增加感染风险。”

生物药物通常旨在靶向多种炎性细胞因子和通路，包括白细胞介素-1 (IL-1)、IL-6 和肿瘤坏死因子-α (TnF-α)。但是，尽管RA疾病的严重程度可能会随时间而波动，但无论细胞因子水平或RA症状如何，药物往往会以高浓度持续给药。“开发能够感知和响应内源性炎症介质水平的特定治疗策略，可以克服在持续递送细胞因子抑制剂时观察到的一些挑战，并减轻不必要的不良反应。”该团队继续说道。

“基本上按需提供此类药物以应对关节炎发作的想法对我们这些与关节炎患者一起工作的人极具吸引力，因为这种方法可以限制伴随这些药物连续大剂量给药的不良反应。”Guy and Ella Mae Magness医学教授、风湿科主任、合著者Christine Pham医学博士评论道。

华盛顿大学再生医学中心联合主任Guilak和他的团队此前已经开发出一种可以被干细胞包裹，然后植入关节形成软骨的支架。这种策略允许研究人员以几天后不会漂移的方式植入工程软骨细胞，并且它们可以存活数月或更长时间。

Guilak实验室此前还利用CRISPR-Cas9技术构建了所谓的SMART软骨细胞（用于自主再生疗法的干细胞），以改变这些细胞中的基因，从而当软骨中的基因被炎症激活时，它们就会分泌出相应的药物。

在最新报告的研究中，Guilak的团队将这两种策略结合起来，为类风湿性关节炎创造了一种新的治疗方法。为了开发植入式细胞疗法，研究人员使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术来设计诱导多能干细胞，这些干细胞会分泌一种抗细胞因子生物药物来应对炎症。该药物通过与细胞因子IL-1结合来减轻关节炎症，IL-1可以通过激活关节中的炎症细胞来促进关节炎症。“我们使用IPSC的CRISPR-Cas9基因组编辑来创建一个合成基因回路，该回路可以感知内源性炎症细胞因子水平的变化，从而触发成比例的治疗反应。”该团队解释道。

“这些细胞会在皮下或关节中停留数月，当它们感觉到炎症环境时，就会被编程释放出一种生物药物。”Guilak说，他也是圣路易斯儿童医院的研究主任。抗细胞因子生物药物类似于免疫抑制剂anakinra，后者与IL-1结合并阻断其活性。有趣的是，这种药物并不经常用于治疗类风湿性关节炎，因为它的半衰期很短。

研究小组指出：“尽管IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra）在RA动物模型中已被证明可以减轻疾病，并减缓人类关节损伤（通过放射评估），但由于其半衰期短且作用温和，因此它并没有被常规用作RA的疾病治疗生物制剂。”

但在他们对植入细胞的小鼠进行的研究中，该药物减少了炎症，防止了类风湿性关节炎常见的骨损伤类型。“我们的研究结果表明，IL-1Ra的动态、自动调节释放减轻了K/BxN关节炎的炎症、疼痛和结构损伤，在这方面优于传统的疾病缓解抗风湿药物（DMARDs）。”作者指出，“与传统的疾病缓解药物和生物制剂相比，这种治疗方法完全消除了骨侵蚀，而这还需要通过每日皮下注射IL-1Ra（anakinra）来实现。”

“我们专注于骨侵蚀，因为这对类风湿性关节炎患者来说是一个大问题，目前的生物制剂无法有效治疗这种疾病。”共同第一作者、Guilak实验室的访问整形外科医生Yunrak Choi医学博士说，“我们使用成像技术仔细检查动物的骨骼，我们发现这种方法可以防止骨侵蚀。我们对这一进展感到非常兴奋，它似乎满足了一个重要的未满足的临床需求。”

利用CRISPR-Cas9基因编辑，细胞可以被编程来制造不同类型的药物是可行的，这意味着如果一种关节炎药物对特定患者的疗效优于另一种，那么就有可能设计软骨细胞进行个性化治疗。该策略还具有治疗其他炎症性关节炎的巨大潜力，包括幼年型关节炎，这种疾病在美国影响了超过30万名儿童。

“许多关节炎患者必须自行服用这些药物，每天、每周或每两周注射一次，而其他患者则每隔几个月到医生办公室注射其中一种生物制剂，但在这项研究中，我们已经证明，我们可以将活组织制成药物输送系统。”Guilak实验室的博士后研究助理、该研究的共同第一作者Kelsey H. Collins博士说，“这些细胞可以感知问题并通过产生药物作出反应。”作者总结道：“目前基于细胞的抗细胞因子疗法动态感知环境并对环境做出反应，因此该功能有助于克服半衰期短和清除速度快的问题，因为IL-1Ra是在刺激下持续合成的，而不是在一次快速清除的单次推注中递送。”

Collins进一步指出：“这种方法也有助于我们理解为什么某些生物制剂对炎症性关节炎的作用有限。这并不是因为它们没有与正确的靶点结合，而是可能是因为与植入的SMART细胞自动控制的药物释放水平相比，注射药物的寿命很短。”

研究人员正在继续使用CRISPR-Cas9和干细胞进行实验，甚至是可能制造多种药物以应对不同炎症触发因素的工程细胞。“通过利用iPSC作为细胞来源的灵活性，这种方法可以很容易地扩展以产生在未来可以广泛应用并分化为任何细胞类型的治疗性细胞，在已确定了明确的生物靶点的情况下，允许更多的应用来解决各种慢性病和组织类型。”他们建议，“正在进行的研究正在寻找其他生物材料和合成基因回路，以便在其他慢性炎症疾病模型中进一步调节细胞反应。”