一、转录组SRA（Sequence Read Archive）数据组装FASTA文件流程:
（1）下载SRR数据：使用SRA Toolkit中的prefetch和fasterq-dump或fastq-dump工具。
（2）质量控制和修剪：使用FastQC检查质量，然后用Trimmomatic处理。
（3）组装转录本：使用Trinity（适用于真核生物）或SPAdes（可能更适合原核？需要确认）等工具。
（4）评估组装质量：使用BUSCO或TransRate等。
（5）输出FASTA文件：组装后的结果通常就是FASTA格式。
需要注意的细节：是否需要去除rRNA？是否需要比对到参考基因组（如果有的话）来进行指导组装？如果用户有参考基因组，可能可以使用StringTie等工具进行参考转录组组装，但如果没有，则需从头组装。
另外，可能需要解释每个步骤的目的，例如质量控制的重要性，以及不同组装工具的适用场景。例如，Trinity适用于真核生物，而SPAdes可能更适合原核或较简单的转录组。此外，在组装后可能需要去冗余，使用CD-HIT等工具聚类相似的转录本。
1. 下载SRR数据并解压SRA文件加验证文件
###使用NCBI的SRA Toolkit下载原始数据：
prefetch SRRXXXXXXX # 替换为实际SRR编号
###判断拿到的数据是单端还是双端数据，可以用fastq-dump -X 1 --split-spot SRRxxxxxxx.sra来判断测序类型。如果返回值是4，就是单端SE；如果返回值是8，那么就是双端PE。
fastq-dump -X 1 --split-spot -Z SRR5489805.sra | wc -l
###使用fastq-dump工具解压SRA数据，把双端测序文件分开
fastq-dump --split-files --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' SRRXXXXXXX
#####验证生成的文件： 正确格式应显示类似：@SRR6892154.1_1/1 @SRR6892154.1_1/2
head -n 1 SRR6892154_1.fastq
head -n 1 SRR6892154_2.fastq
常见的参数有三类:
--split-spot: 将双端测序分为两份,但是都放在同一个文件中
--split-files: 将双端测序分为两份,放在不同的文件,但是对于一方有而一方没有的reads直接丢弃
--split-3 : 将双端测序分为两份,放在不同的文件,但是对于一方有而一方没有的reads会单独放在一个文件夹里
2. 质量控制与修剪-----质量好的可以不做修剪，直接组装
###质量检查：使用FastQC生成报告
fastqc SRR8652038_1.fastq SRR8652038_2.fastq
###fastqc的使用方法：
fastqc -t 12 -o out_path sample1_1.fq sample1_2.fq
运行结束后生成两个文件一个.html网页文件，一个是.zip压缩文件。
常用参数：
-o 用来指定输出文件的所在目录，生成的报告的文件名是根据输入来定的，注意是不能自动新建目录的。输出的结果是.zip文件，默认不解压缩，命令里加上--extract则压缩。
-f 用来强制指定输入文件格式，默认自动检测。支持fastq、bam、sam极相应的gz压缩格式
-c 污染物选项，输入的是一个文件，格式是Name[Tab] Sequence，#开头的行是注释，里面是可能的污染序列，如果有这个选项，FastQC会在计算时候评估污染的情况，并在统计的时候进行分析。
-q 会进入沉默模式，指定这个选项的时候，程序不会实时报告运行的状况，即不出现下面的提示：
####修剪低质量序列和接头：使用Trimmomatic
trimmomatic PE -threads 4 SRR8652038_1.fastq SRR8652038_1.fastq
SRR8652038_1_trimmed_paired.fq SRR8652038_1_unpaired.fq \
SRR8652038_2_trimmed_paired.fq SRR8652038_2_unpaired.fq \
ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:50
###查看trimmed后的文件中的reads名称是否符合Trinity的要求：
head -n 4 SRR9023132_1_trimmed_paired.fq
head -n 4 SRR9023132_2_trimmed_paired.fq
问题：如果遇到fastq格式报错解决办法：
确保文件是标准的FASTQ格式。
每对双端测序的reads名称（除了 /1 和 /2）必须完全一致
1、开始检查错误
head -n 4 SRR9023133_1.fastq
head -n 4 SRR9023133_2.fastq
####输出结果
@1/1
GTTGTGGTCTCACACTCGCAAGATTTTTTGAATGGTGTCTGTACCAACATGATTCACATGCAAAACAAGAAGTTGAAATTTTACACTGGT
+SRR9023133.1 1 length=90
JJFFFFJJJJJJJJJFJJJJJJJFJJ-FJAJF7FAFF-F<FAFJFFFJJJJJFJAA7AA7-7AAAFFJJFJF-F-FJJFFAFA<JJFJFF
@1/2
GTTCCCATCTGTACTGCTTCATCTGGTTCTCCTCCAGCTCTGTCCTGGTTTGGATACACTGGTCGTAATTACCAGTGTAAAATTTCAACT
+SRR9023133.1 1 length=90
FJJJJJJJJJJJJJJJJFJJJJJJJJJJJJJJJJJAJJJ7FJJJJJJJJFJJJFJF7<7AJFJ-7AFJFFJFAAFAAJFFAFJFJ-<A7F
加粗的地方显示格式不对，手动进行修改：
（1）在文件1中，序列标识符为@1/1，但在质量分数行中出现了+SRR9023133.1 1 length=90。
（2）在文件2中，序列标识符为@1/2，质量分数行同样出现了+SRR9023133.1 1 length=90。
这种不一致可能会导致Trinity或其他工具解析时出现问题。建议统一序列标识符的格式，例如：
将@1/1和@1/2改为@SRR9023133.1/1和@SRR9023133.1/2。
质量分数行的标识符也应与序列标识符一致，例如+SRR9023133.1/1和+SRR9023133.1/2。
####解决方法：
使用以下命令修复文件格式：
###检查文件完整性
# 修复文件1
awk '{if(NR%4==3) {print "+" $1 "/1"} else {print}}' SRR9023133_1.fastq > modified_SRR9023133_1.fastq
# 修复文件2
awk '{if(NR%4==3) {print "+" $1 "/2"} else {print}}' SRR9023133_2.fastq > modified_SRR9023133_2.fastq
检查文件完整性
#验证修改后的结果：
head -n 4 modified_SRR9023133_1.fastq
head -n 4 modified_SRR9023133_2.fastq
@1/1
GTTGTGGTCTCACACTCGCAAGATTTTTTGAATGGTGTCTGTACCAACATGATTCACATGCAAAACAAGAAGTTGAAATTTTACACTGGT
+SRR9023133.1/1
JJFFFFJJJJJJJJJFJJJJJJJFJJ-FJAJF7FAFF-F<FAFJFFFJJJJJFJAA7AA7-7AAAFFJJFJF-F-FJJFFAFA<JJFJFF
@1/2
GTTCCCATCTGTACTGCTTCATCTGGTTCTCCTCCAGCTCTGTCCTGGTTTGGATACACTGGTCGTAATTACCAGTGTAAAATTTCAACT
+SRR9023133.1/2
FJJJJJJJJJJJJJJJJFJJJJJJJJJJJJJJJJJAJJJ7FJJJJJJJJFJJJFJF7<7AJFJ-7AFJFFJFAAFAAJFFAFJFJ-<A7F
运行Trinity组装：
###修剪低质量序列和接头：使用Trimmomatic，加了&后直接在后台运行
Trinity --seqType fq --left SRR9023132_1.fastq --right SRR9023132_2.fastq --CPU 8 --max_memory 60G --output trinity_out_9023132 &
结果文件：trinity_out/Trinity.fasta
关键参数说明：
--seqType:支持输入数据格式为fq或者fa
--max_memory:内存设置，这一步是最耗费资源的一步，所以这个内存主要由jellyfish控制
--left --right：如果是双端测序--left为read1，--right为read2，多个样品的reads由逗号隔开，不允许出现空格；如果是单端测序，参数为--single加上文件，多个样品的reads由逗号隔开，不允许出现空格。
--CPU：软件所用线程
