细胞准备
1. 细胞选择：通常选择具有成骨分化潜能的细胞，如骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等。确保细胞的质量和活性，在实验前对细胞进行检测，如细胞表面标志物检测、细胞纯度判断等。
2. 细胞接种：取对数生长期的细胞，按照一定的细胞密度接种至培养器皿中。例如，可按照2x10^4 cells/cm^2的细胞密度接种，在37℃、5%CO2的培养环境下培养，直至细胞汇合度达到60%-70%左右。
诱导培养基配制
1. 基础培养基：常用的基础培养基有α-MEM或DMEM等，根据所培养细胞的特性选择合适的基础培养基。一般在基础培养基中添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的双抗（青霉素-链霉素），以提供细胞生长所需的营养和抑制细菌、真菌的污染。
2. 诱导因子添加：在基础培养基中加入成骨诱导因子，主要包括抗坏血酸（维生素C，终浓度为50μg/ml）、β-磷酸甘油（终浓度为10mM）和地塞米松（终浓度为100nM）。这些诱导因子可以促进细胞向成骨细胞分化。
细胞分化诱导
诱导培养：当细胞达到合适的汇合度后，弃掉上清，加入配制好的成骨诱导培养基。将细胞置于37℃、5%CO2的培养环境中进行培养，每2-3天更换一次成骨诱导培养基，以保证细胞有充足的营养和诱导因子。
观察与终止：定期观察细胞的形态变化，诱导14-21天左右（具体诱导时间根据细胞类型和实验目的而定），当细胞出现钙盐结晶析出和钙质结节形成等现象时，可考虑终止细胞诱导。
染色鉴定
1. 细胞固定:吸去培养基，使用适量的1XPBS清洗细胞1-2次，弃去PBS后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30-60min。固定完成后，弃去固定液，再用1XPBS清洗细胞2次。
2. 茜素红染色:加入适量的茜素红染液，室温下染色3-30min(具体染色时间根据实际情况调整)。染色结束后，吸去茜素红染液，用1XPBS清洗细胞2-3次，以去除未结合的染液。
3. 诱导评估:将染色后的细胞置于显微镜下观察成骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，钙质结节会与茜素红染料结合后呈现红色或橘红色。
注意事项
1. 细胞质量控制
·在实验开始前，要确保细胞的状态良好，没有老化、污染、分化异常等问题。例如，老化的细胞增殖速度变慢，形态会发生变化，可能会影响成骨诱导的效果。
· 对细胞的来源、纯度等进行严格的检测和把控，避免因细胞质量问题导致实验结果不准确。
2. 培养基和诱导因子
· 诱导培养基中的各成分要按照正确的比例和浓度添加，配制过程中要注意充分混匀，确保诱导因子的有效性。
· 诱导因子的储存要严格按照要求进行，如抗坏血酸和地塞米松见光易分解，应避光保存; β-磷酸甘油粉末易受潮吸水，需密封并按照说明书存于4℃。
3. 培养条件
· 细胞培养的环境要保持稳定，温度、CO2浓度等要严格控制在合适的范围内。培养箱要定期进行清洁和消毒，避免细菌、真菌等污染。
· 换液时要注意操作轻柔，避免对细胞造成机械损伤，尤其是在细胞形成钙质结节后，更要小心操作，防止钙沉积流失。
4. 染色操作
· 染色过程中的各个步骤要严格按照操作规程进行，如固定时间、染色时间、清洗次数等都要准确把握，以确保染色效果的准确性。
· 在固定之前操作要轻柔，避免细胞成片脱落导致实验无法继续;固定后相对不易脱壁，但也尽量避免较大的液流冲击。
5. 实验对照设置
· 为了确保实验结果的可靠性，应设置合适的对照组，如未进行成骨诱导的细胞对照组、使用不同诱导因子浓度或组合的实验组等，以便对实验结果进行比较和分析。
