1. Stroke induces long-term inflammatory changes in systemic monocytes/macrophages
为了探究stroke对长期全身性炎症的潜在作用，作者对experimental ischemic stroke后一个月的小鼠(脑损伤后炎症的急性期)血液、心脏、肺脏、肝脏和脾脏的CD45+CD11b+ 髓系细胞进行了单细胞测序(a)。注释得到了29,124个髓系细胞和20个独立的群(b)。差异分析发现ly6chigh的单核细胞出现了最显著的转录变化(c)，且促炎性显著增强，趋化因子和粘附分子、细胞因子和干扰素、模式识别受体等表达都增加(d)。PCA结果显示心脏和肝脏的单核巨噬细胞变化较显著，其他脏器的单核巨噬和对照相比，转录变化较轻微(e)。单细胞也显示，stroke 1月后心脏的ly6chigh的单核细胞比例增加(f, g)，单核向巨噬的分化也增加(h)，因此作者将其命名为‘‘post-stroke monocytes/macrophages’’ 。
Taken together, these results suggest that stroke chronically promotes the recruitment of circulating Ly6Chigh monocytes to the heart, which might further differentiate into tissue-resident macrophages.
2. Stroke results in chronic cardiac diastolic dysfunction
为了探究心脏单核巨噬细胞变化对心功能的影响，作者检测了检测了stroke 后小鼠的心功能，发现end-diastolic left ventricle (LV) volume持续下降，而收缩功能(ef和fs)只受到了短暂的影响(a)。由于患者HFpEF常有心脏纤维化，作者检测了小鼠心脏纤维化情况，发现脑梗后小鼠心脏纤维化增加(b)。invasive electrophysiological (EP) study也提示，脑梗后1月，小鼠室性心律失常发生更多(c)。小鼠心脏中的纤维化主要是i型胶原(d)。second harmonic generation microscopy 提示 fiber disorganization增多(e)，提示除了胶原沉积增加以外还存在ECM remodeling。接着作者检测了调控ECM remodeling的酶活性，发现MMP9显著增加(f)，且主要表达于心脏巨噬细胞(g)。与单细胞结果一致，心脏流式结果也显示心脏存在显著单核和巨噬的增加(h)。此外，外周血单核表达mmp9也增加(i)。
接下来作者探究了这些观测的转化意义。作者对Stroke-Induced Cardiac Failure (SICFAIL) study consortium中的脑梗患者在3月和6月检测了他们的心功能(a)，发现存在显著下降。作者还获得了脑梗后1-3月内死亡患者的尸检组织和性别年龄匹配但没有心脑损伤的对照样本(b)，发现存在显著纤维化和胶原沉积(c, d)。post-stroke心脏中巨噬也增加，且与胶原沉积情况呈正相关(e-g)。且post-stroke的心脏巨噬也高表达mmp9(h)。对心脏组织的RNAseq也发现对照和post-stroke心脏存在显著转录差异，尤其是ECM remodeling等通路被显著富集(i, j)。
Taken together, we observed marked cardiac fibrosis and ECM remodeling in both experimental mice and stroke patients, which was further associated with diastolic dysfunction after experimental stroke. A hallmark of this secondary cardiac pathology after stroke is the increased recruitment and pro-inflammatory profile of cardiac monocytes/macrophages.
3. Stroke promotes chronic monocyte recruitment into the heart
接着作者使用了inducible myeloid progenitor reporter mouse strain (Ms4a3creERT2xAi14)，观测到stroke后单核巨噬存在持续的向心脏的招募，这种现象不仅在急性期存在，在慢性期也存在(a)。结合在体的5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU)-labeling 实验，作者发现stroke后一个月超过95%的心脏髓系细胞被更新(b)，提示新迁入的巨噬对心功能起着重要影响。因此作者随后使用Ccr2creERT2xAi14探究了外周血单核对脑梗后心脏纤维化的影响。作者使用单细胞分析了对照和脑梗后1月的小鼠心脏间质细胞，得到了7种细胞(c, d)。Ccr2-tdTomato(tdT)在4群单核巨噬亚群中显著富集(e, f)。轨迹分析也显示外周Ly6Chigh单核浸润入心脏，获得了组织原位单核/巨噬表型(g, h)。此外，脑梗后 tdT+ 细胞上调了多种炎症相关通路(i)。将 tdT+ 细胞作为信号发出细胞，将成纤维做为信号接收细胞的细胞互做分析提示大量上调的互做信号与组织纤维化和炎症有关(j)。fish染色也提示脑梗后慢性期vimentin阳性成纤维显著增加，且一型胶原的转录本高表达(k)。
4. BM cellularity and function are chronically altered after stroke
为了探究post-stroke免疫介导的心功能是失偿，作者对骨髓髓系细胞进行了深入分析，得到了21个群(a)。轨迹分析构建了从HSPCs到其他髓系细胞群的分化轨迹(b)，并鉴定出一个stroke后Ly6Chigh单核的特异性分化轨迹(c)。此外，HSPCs也存在显著转录变化，提示其在脑梗后存在长期改变(附图)。流式验证了骨髓中细胞的相应变化(d, e)。
5. Stroke induces persistent innate immune memory
为了证实观测到的脑梗后髓系细胞变化和心功能损伤的潜在因果关系，作者将stroke后1月和对照的小鼠的HSPCs(带GFP)移植给genetic骨髓清除小鼠(poly(I:C) administration to Mx1Cre:c-mybfl/fl mice)(f)。一个月之后，作者分选了骨髓血液和心脏GFP阳性的细胞，进行了单细胞测序(g)。结果显示接受了stroke小鼠HSPC移植的小鼠和stroke小鼠骨髓细胞一样存在着显著的促炎性(h), confirming that myeloid cells acquire a distinct pro-inflammatory phenotype after stroke that is transmissible by BM transplantation.
接着作者对血和心脏的巨噬做了联合分析，轨迹分析结果显示stroke引起了血单核到心脏巨噬的轨迹变化(i)，表现为更高的血ly6Chigh单核细胞向组织原位单核/巨噬的分化(i, j)。接收stroke小鼠骨髓移植的小鼠，心脏中移植HPSC的GFP+单核/巨噬细胞中Mmp的表达也更高(k, l)，小鼠心脏纤维化也更重(m)。Together, these findings demonstrate that myeloid function is not only stably altered after stroke but that these changes in the myeloid compartment are sufficient to drive secondary cardiac fibrosis。
6. Innate immune memory is mediated by early post-stroke IL-1b secretion
前面的结果提示脑梗后免疫细胞形成了训练免疫。脑梗后小鼠单核和bmdm的吞噬能力确实更强(a)。训练免疫的一个特征性标准是表观重塑。因此作者首先评估了stroke一月后和对照小鼠的组蛋白修饰，发现H3K4me1和H3K27ac (enhancer associated marks)和H3K4me3 (a histone modification associated with active promoters) 的变化(supp6b)。接着，作者想要去探究是否类似的TFs参与了HSPC和单核启动子区的表观重塑，并鉴定出了差异性的TF motif。在hpsc中鉴定出了CTCF, STAT1/2, GABPA, CEBPD, GFI, 和KLF14 (b)。这些tf此前被报道调控HSPC的存活和增殖。与HPSC中类似，在单核中发现H3K4me3水平与stroke后多种 motif 紧密相关，包括CTCF, NFkb和IL1信号通路及促炎性反应如E2F2, ATF7, STAT1和KLF14 (c)。
在作者此前的研究中，报道了脑梗后IL1b分泌以应对组织损伤。且IL1b被报道可以参与表观修饰和训练免疫。因此作者使用il1b中和抗体干预了对照和脑梗后1月的小鼠，进行了单细胞atac测序，得到了Lin-CD45+CD11b+的13520个细胞核，分为11个群(d)。接着作者鉴定了组间差异性的TF motif (e)，这些结果提示stroke引起了显著的tf活性改变，包括CTCF, ETV4 和 RUNX2，这些转录因子都被报道过参与调节HSPC的功能。而中和IL1B则可以阻断这些变化(e)。体外骨髓细胞的ATACseq也得到了类似的结果。Altogether, these results demonstrate the critical role of IL-1b in inducing epigenetic changes leading to post-stroke- trained immunity.
7. IL-1b-driven innate immune memory mediates remote organ dysfunction after stroke
为了进一步探究IL-1b的功能，作者对对照小鼠进行了重组IL-1b注射(a)，流式结果提示Ly6Chigh单核和CCR2high单核巨噬在重组IL-1b注射小鼠心脏中显著升高(b)，髓系造血也增加(c)。对stroke后一月小鼠使用IL-1b中和抗体，骨髓HSPC, 单核,巨噬、外周血单核和心脏单核/巨噬数量都下降(d-g)。使用中和抗体后小鼠心脏纤维化减轻，mmp9表达也下降(h-i)。
8. Blocking BM-to-heart trafficking of monocytes prevents post-stroke cardiac dysfunction
最后作者使用CCR2-CCR5 dual antagonist cenicriviroc (CVC)来阻断髓系细胞从BM向心脏的趋化，得到了很好的治疗效果。
