sanger测序法：
- 脱靶位点预测
1.1 登陆 http://www.rgenome.net/cas-offinder/ 网站，输入靶点序列，自动预测易脱靶位点。
1.2 本次参数:SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3';Sus scrofa (susScr11) - Pig;Mismatch Number 4;DNA Bulge Size 2;RNA Bulge Size 2。 - 数据筛选与整理
2.1 下载数据后使用excel工具打开并进行筛选，筛选条件根据自己要求自己设定，本次设定：Mismatch Number 1;Bulge Size 2
2.2 根据position位置整理信息，三列：chr position+300 position-300 - 序列抓取
3.1 登录 https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/susScr11/bigZips/ 网站，下载猪的基因组序列。
3.2 解压数据，使用tbtools工具（Fasta Extract（Recommended））进行序列提取，input放入基因组序列，out设置输出位置和名字，idlist输入2.2整理信息，start - 引物设计
将3.2获得的序列信息整理到word中，使用bioXM工具辅助设计引物。 - PCR扩增、检测、测序
使用上步设计的引物进行扩增，电泳检测后送公司进行测序。 - 测序结果分析
将预测脱靶位点上下游300bp序列BLAST到靶点序列，输出模式为pairwise方便定位靶点信息，定位好靶点信息后，将靶点信息序列在测序峰图中检索，确认测序结果与预测脱靶位点是否一致，若一致则未脱靶。
高通量测序法：
- 脱靶位点预测
1.1 登陆 http://www.rgenome.net/cas-offinder/ 网站，输入靶点序列，自动预测易脱靶位点。
1.2 本次参数:SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3';Sus scrofa (susScr11) - Pig;Mismatch Number 5;DNA Bulge Size 2;RNA Bulge Size 2。 - 数据筛选与整理
下载数据后使用excel工具打开并进行筛选，筛选条件根据自己要求自己设定，本次设定两个参数，参数一：Mismatch Number 2;Bulge Size 1，参数二：Mismatch Number 0;Bulge Size 2，参数二：Mismatch Number 3;Bulge Size 0，去除冗余位点后共计99个。 - 全基因组snp分析
高通量测序由公司进行，将2中设定的潜在脱靶位点与产生的SNP位点比对, 若snp位点处于潜在脱靶位点位置序号±20bp 的范围，进一步进行序列比对，查看是否脱靶。若snp位点处于潜在脱靶位点位置序号±20bp 的范围之外，则可初步判定该位点未发生脱靶。
NOTE:
DNA Bulge Size
定义：在sgRNA与DNA靶序列配对时，若DNA链上出现无法与sgRNA配对的额外碱基，这些未配对的碱基会在DNA链上形成局部凸起（类似“鼓包”），称为DNA Bulge。
示例：
sgRNA序列：A-A-A-A-A
DNA靶序列：A-A-C-G-A-A-A
此时，中间的C-G无法与sgRNA配对，导致DNA链上出现2个未配对的碱基（Bulge Size=2）。
意义：
CRISPR系统（如Cas9）允许DNA靶序列存在少量未配对碱基（Bulge），但仍可能切割。预测工具通过设置DNA Bulge Size参数，可评估允许的DNA凸起大小（如0、1、2个碱基），从而筛选潜在的脱靶位点。RNA Bulge Size
定义：若sgRNA链上存在无法与DNA靶序列配对的碱基，这些碱基会在RNA链上形成凸起，称为RNA Bulge。
示例：
sgRNA序列：A-A-G-A-A-A
DNA靶序列：A-A-A-A-A
此处sgRNA中的G无法配对，导致RNA链出现1个未配对碱基（Bulge Size=1）。
意义：
与DNA Bulge类似，RNA Bulge的存在可能影响CRISPR系统的结合效率。预测工具通过设置RNA Bulge Size参数，控制允许的RNA凸起大小。
3.为什么需要关注这两个参数？
脱靶效应容忍度：CRISPR系统对DNA或RNA链上的少量Bulge有一定容忍度，可能导致意外切割（脱靶）。
预测准确性：
若设置DNA/RNA Bulge Size=0，仅预测完全匹配的位点（严格，但可能漏检）；
若设置Bulge Size=1-2，会纳入含凸起的潜在脱靶位点（敏感，但假阳性可能增加）。
实验设计：合理调整这两个参数，可平衡预测结果的敏感性与特异性，优化sgRNA设计。
4.应用示例
假设使用工具Cas-OFFinder预测脱靶位点：
若设置DNA Bulge Size=2，工具会筛选DNA链上最多有2个未配对碱基的位点；
若设置RNA Bulge Size=1，则会纳入RNA链上有1个未配对碱基的位点。
通过调整这些参数，研究者可以更全面地评估sgRNA的潜在脱靶风险，从而设计出更安全的基因编辑方案
