2023-10-30 CRISPR-cas9 脱靶检测流程

  1. 脱靶位点预测
    1.1 登陆 http://www.rgenome.net/cas-offinder/ 网站，输入靶点序列，自动预测易脱靶位点。
    1.2 本次参数:SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3';Sus scrofa (susScr11) - Pig;Mismatch Number 4;DNA Bulge Size 2;RNA Bulge Size 2。
  2. 数据筛选与整理
    2.1 下载数据后使用excel工具打开并进行筛选，筛选条件根据自己要求自己设定，本次设定：Mismatch Number 1;Bulge Size 2
    2.2 根据position位置整理信息，三列：chr position+300 position-300
  3. 序列抓取
    3.1 登录 https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/susScr11/bigZips/ 网站，下载猪的基因组序列。
    3.2 解压数据，使用tbtools工具（Fasta Extract（Recommended））进行序列提取，input放入基因组序列，out设置输出位置和名字，idlist输入2.2整理信息，start
  4. 引物设计
    将3.2获得的序列信息整理到word中，使用bioXM工具辅助设计引物。
  5. PCR扩增、检测、测序
    使用上步设计的引物进行扩增，电泳检测后送公司进行测序。
  6. 测序结果分析
    将预测脱靶位点上下游300bp序列BLAST到靶点序列，输出模式为pairwise方便定位靶点信息，定位好靶点信息后，将靶点信息序列在测序峰图中检索，确认测序结果与预测脱靶位点是否一致，若一致则未脱靶。
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