Highlights

• Tertiary lymphoid structures are sites of in situ B cell maturation toward plasma cells
• IgG+ and IgA+ plasma cells disseminate into the tumor tissue along fibroblastic tracks
• Tumor cells are labeled by locally produced IgG
• Patients with IgG-labeled tumor cells have high response rate to ICI and prolonged PFS

背景知识：

一级淋巴器官，也可以称为初级淋巴器官，又称中枢淋巴器官，主要有胸腺，骨髓和腔上囊（禽类独有，或称法氏囊），这些器官的淋巴细胞不能直接参与机体的免疫功能，而要经过分化，才能特异性免疫。一级淋巴器官是造血干细胞增殖、分化成为Naive T、B淋巴细胞的场所，并向周围淋巴器官输送淋巴细胞，促进周围淋巴器官的发育。
二级淋巴器官又称为外周免疫器官或周围淋巴器官，包括脾、淋巴结、咽扁桃体、阑尾，以及分布在全身的淋巴小结和淋巴组织。在免疫反应的个体发育中，受中枢淋巴组织的影响，是T细胞和B细胞等定居和增殖的场所。外周淋巴器官接受和容纳由中枢淋巴器官迁来的淋巴细胞。 在抗原刺激下，淋巴细胞增殖分化，产生参与免疫应答的T效应细胞或浆细胞。T效应细胞产生和释放各种淋巴因子（lymphokin），浆细胞分泌抗体。周围淋巴器官广泛分布于全身各重要部位，形成第二道免疫防线。
三级淋巴结构（TLSs）是后天在非淋巴组织中形成的免疫细胞的组织聚集物。TLS不是在生理条件下发现的，而是在慢性炎症的背景下产生的，如自身免疫性疾病、慢性感染和癌症。TLS的结构与次级淋巴结构类似。可以看成是一个架构在成纤维细胞网络上的淋巴细胞聚集体，包含两个重要的结构区域：T细胞区（如下图，T cell zone）和（滤泡）B细胞区。成熟的三级淋巴结构被定义为存在有生发中心（Germinal centre，GC），GC内含有T滤泡辅助细胞和滤泡状树突细胞，GC是产生记忆B细胞和长寿命浆细胞的重要场所，其中长寿命浆细胞又可以分泌高亲和力的抗体。有研究揭示三级淋巴结构与B细胞共同影响了癌症的预后以及对免疫检查点治疗的效果。而且除了少数例外，肿瘤中TLS的存在与免疫治疗后更好的预后和临床结果相关。但是，TLS在癌症中的形成的驱动因素以及这些结构对肿瘤内免疫反应的贡献仍不完全清楚，具体是哪种B细胞和浆细胞在此发挥了重要的作用也尚不明确。

肿瘤中三级淋巴结构的组成和功能（Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy）

Science 375, eabf9419 (2022)

SUMMARY

肿瘤内三级淋巴结构 (TLS) 的存在与较好的临床预后和对癌症免疫治疗的反应有关。在这里，作者10x Genomics Visium FFPE空间转录组技术探究了肾细胞癌 (RCC) 中 TLS 内 B 细胞成熟和浆细胞 (PC) 的形成过程。
B细胞repertoire分析揭示了 TLS 中的B细胞克隆的多元化、选择和扩增，以及远端完全成熟的克隆型的存在。
在 TLS⁺ 肿瘤中，产生 IgG 和 IgA 的 PC 沿着fibroblastic tracks播散到肿瘤床中。
TLS⁺ 肿瘤存在大量产IgG 的 PC 和 IgG 染色阳性的凋亡的肿瘤细胞，提示了TLS中产IgG PC的抗肿瘤效应。在接受免疫检查点抑制剂治疗的 RCC 患者中，治疗反应和无进展生存期与 IgG 染色阳性的肿瘤细胞相关。因此，肿瘤内 TLS 维持与免疫治疗反应相关的 B 细胞成熟和抗体产生，产生直接的抗肿瘤作用。

该研究的样本来自3个队列的130个treatment-naive的ccRCC患者。作者对其中24个样品进行了空间转录组检测，对全部130个样品做了免疫组化，免疫荧光和基于AI的proximity assessment来分析了肿瘤微环境的结构。

Figure S1

1. Spatial TME architecture unveils areas of B cell rich hot spots in TLS+ tumors

为了分析TLS对TME结构的影响，作者对 frozen (n = 12) 和 FFPE (n = 12) 的24个 ccRCC原发性肿瘤进行了10x空间转录组的检测。（frozen：8个TLS⁺，4个TLS^-；FFPE：10个TLS⁺，2个TLS^-）
在对切片进行 HE 染色后，经验丰富的病理学家 (VV) 对每个肿瘤的整体组织以及TLS 的存在和定位进行了注释。Fig 1展示了一个 TLS⁺ 冷冻切片肿瘤（Fig 1A-C）、一个 TLS⁺ FFPE 肿瘤（Fig 1D-F）和一个 TLS^- 冷冻切片肿瘤（Fig 1G-I）。

碳酸酐酶9（蛋白质名称：CAIX，基因名称：Ca9）是ccRCC肿瘤细胞的标志物，在24个样品中，23个检测到了Ca9，这和其在大多数ccRCC肿瘤中表达相一致，并且在肿瘤切片中Ca9分布均匀 (Fig 1B, E, H)。使用微环境细胞群 (MCP)-counter评估 TME 的免疫和基质细胞群的分布，该counter可以从转录组数据估计细胞类型丰度¹。在下图所示的 TLS⁺ 肿瘤中，B 细胞谱系（包含识别从幼稚细胞到 PC 的所有成熟步骤的基因）和 T 细胞（识别不同的 T 细胞群）基因特征优先在TLS 区域中表达（Fig C, F） 。
对TLS和其他肿瘤区进行比较可以发现TLS区的B细胞谱系和T细胞评分更高(p < 2e–16 respectively, Fig S2 A, B)。而且肿瘤表现出 CD8 T 细胞特征的低表达，但在 TLS 区域略有富集（p = 0.017）。 TLS 中的单核细胞谱系特征略高（分别为 p = 0.00081 和 p = 0.035），而 NK 细胞更广泛地分布在整个肿瘤切片中。内皮细胞和中性粒细胞均匀分布，在 TLS 内得分较低），而在 TLS 区域发现成纤维细胞特征的高表达。
TLS^- 肿瘤没有显示出上述组织模式(Fig 1I)，MCP counter 分析显示 B 细胞谱系评分非常低且分散分布，其他免疫和基质也是分散分布。这些不同的 TME 空间组织模式在 8 个 TLS⁺ 和 4 个 TLS^- 冷冻切片肿瘤以及 10 个 TLS⁺ 和 2 个 TLS^- FFPE 肿瘤中始终可以识别，这表明 TLS 与 B细胞谱系、T 细胞和成纤维细胞特征的表达有关。

Fig 1

Figure S2, frozen

Figure S2, FFPE

Figure S3

2. Immunoglobulin (Ig) gene expression inside and at distance from TLS

为了确定 TLS 在肿瘤中的转录组学印记，作者在冷冻切片的连续切片上通过CD20/CD3/PD-1三色 IF 确认了 HE 定义的 TLS 位置(Fig 2A, B)，在 FFPE 样品上通过CD3/CD20的IHC确认了 HE 定义的 TLS 位置(Fig 2F, G)。随后作者在 TLS 和肿瘤区域之间进行了基因差异表达分析。

通过留一交叉验证(leave-one-out cross validation)对 4 个冰冻的 TLS+ 肿瘤进行了 TLS 印记markers的研究 (a method that performs sequential permutations by identifying genes from 3 tumors and validating them on the fourth one)。平均 FC > 2 且 p.adj < 0.05（Bonferroni 校正）的基因被纳入分析 (Fig S3A)。作者在signature中选择了在至少 3 个 TLS+ 肿瘤中表达AUC>= 0.7 的基因 (是单个基因对TLS区和非TLS区的区分度>=0.7吗？)，得到了 29 个基因的 TLS imprint signature (Figures S3B and S3C)。该特征包括 12 个免疫球蛋白基因（IGHA1、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHG4、IGHGP、IGHM、IGKC、IGLC1、IGLC2、IGLC3 和 JCHAIN）、5 个 B 细胞标志物（CD79A、FCRL5、MZB1、SSR4 和 XBP1）， 2 个 T 细胞标志物（TRBC2 和 IL7R）、2 个成纤维细胞标志物（CXCL12、LUM）、2 个补体蛋白编码基因（C1QA 和 C7），以及 CD52、APOE、PTLP、PTGDS、PIM2 和 DERL3 基因。这 29 个基因signature是 TLS imprint的标志物，其在discovery冰冻 TLS+ 肿瘤的 AUC 范围为 0.89 至 0.97，而在其余validation冰冻 TLS+ 肿瘤中，其AUC 范围为 0.77 至 0.94 (Figures 2A–2C) 。该特征在12 个 FFPE 肿瘤上也得到进一步验证(Figures 2F–2H)。在 9/10 TLS+ 肿瘤中，该特征 AUC 范围为 0.75 至 0.93。但一个样本例外，AUC 为 0.62 且 TLS 印记特征表达较弱。该肿瘤缺乏 TLS 成熟度标志物，例如 CD23 和 BCL6，以及外周淋巴结寻址素阳性 (PNAd+) 高内皮小静脉 (HEV)。在 4 个冰冻和 2 个 FFPE TLS^- 肿瘤中仅观察到印迹特征的稀疏表达，除了一个肿瘤(a_1)，尽管通过 HE 染色和 CD3-CD20 IF 标记没有观察到 TLS，基因特征识别出了表达 MZB1 PC 相关基因和 IGHG1 的小区域。

Ig 和 B 细胞相关基因在 TLS 印记特征中的显著富集促使作者特别关注了 B 细胞。首先是想要精确定位与 TLS 相关的转录异质性 B 细胞亚型。作者通过robust cell type decomposition RCTD的方法² 使用扁桃体 B 细胞单细胞分析³中定义的 B 细胞亚群对空转数据进行了空间映射。发现naive B 细胞相关基因的表达较低(Figure 2D)，尽管其与 TLS 显著相关(Fig S2C)。并且发现 FCRL4+ 记忆 B 细胞(p < 2e�-16)，GC B 细胞 (p = 0.0087) 和浆母细胞(浆细胞前体)(p = 2e�-16)与TLS 特征相关(Figures 2D and S2C)。PC 相关基因 MZB1 在 TLS 中表达较高，而在冷冻切片的肿瘤区域中总体低 (p = 2e�-16) (Figure S2C)。在 FFPE 肿瘤中也得到了类似的结果 (Figures 2I, S2D)。然而，在肿瘤内的不同位置也观察到许多分散的、远离 TLS 的 MZB1 表达点(Figures 2D and 2I)。 MZB1 是浆母细胞特征的一部分，在 PCs 中高度表达。由于浆母细胞仅限于 TLS 区域(Figures 2D and 2I)，并且在 TLS 外发现 MZB1 的高表达，因此表达 MZB1 的 PC 可能不仅存在于 TLS 中，而且存在于肿瘤bed中。由于 PC 的主要功能是产生抗体，于是作者分析了免疫球蛋白基因的空间表达。 IGHM 几乎只在 TLS 区域表达(p < 2e�-16)，进一步证明了 TLS 内non-switched B 细胞的存在，而 IGHG1、IGHA1 和 pan Ig（IGKC 和 JCHAIN 的几何平均值）基因在 TLS 区域高度表达，但也在肿瘤其他区域表达(Figures 2E, 2J, S2C, and S2D)。IGHG1 和 IGHA1 的分散表达表明isotype-switched PC 已在 TLS 中形成并出现远处迁移。

未成熟B细胞和初始B细胞：mIgM⁺
成熟B细胞：mIgM⁺ mIgD⁺
活化并发生过抗体类别转换：mIgG⁺, mIgA⁺, mIgE⁺(产生的分泌型抗体一部分会暂时留在B细胞表面，成为活化B细胞的标志)

值得注意的是，在与泛 Ig 基因（IGKC、JCHAIN）、IGHG1 和 IGHA1 基因相同的位置发现了泛成纤维细胞标记 COL1A1 的高表达以及 MCP-counter 成纤维细胞特征(Figures 1C, 1F, 2E, and 2J)。此前有报道显示CXCL12 与位于骨髓、淋巴结髓索和慢性炎症组织中的 PC 生态位中的 PC 迁移和滞留有关，我们分析了 CXCL12 的表达，发现它与 MZB1 的表达共定位 (Figure S4A)。

为了进一步评估这些不同signatures之间的空间共定位，每个spot中的各个signature的表达被通过二分法 (使用中值作为截止点)定义为“高”或“低”表达。当一个基因被两个特征共享时，它会从其中一个特征中删除，以避免其对统计分析的影响。因此，当分析TLS/MZB1 overlap的时候，作者从 TLS imprint signature 中删除了 MZB1。当分析TLS 和 CXCL12 基因表达之间的重叠时，则删除了CXCL12。随后通过计算两个特征之间的卡方检验来评估有意义的重叠，并用黄色突出显示分类为“高/高”的点。该分析不仅证实了 TLS 特征与 MZB1、成纤维细胞和 CXCL12 的共定位，而且还证实了成纤维细胞与 CXCL12、MZB1 与成纤维细胞以及 MZB1 与 CXCL12 在距 TLS 一定距离处的共定位 (Figure S4A)。这些共定位在其他 TLS+ 肿瘤中也得到证实，而在 TLS-肿瘤中则观察到轻微或无关联。总体而言，可以得出结论，在 TLS+ 肿瘤中，表达 IGHG1 和 IGHA1 的 PC 存在于 TLS 附近，并且可能与成纤维细胞相关地在肿瘤内迁移。

Figure 2

Figure S3

Figure S4

3. Spatial B cell receptor (BCR) profiling identifies in situ hypermutation and clonal selection

TLS 中 B 细胞成熟亚型和 PC 的共定位提示了原位 B 细胞适应性免疫的产生。在这个过程中，B 细胞会突变其 B 细胞受体 (BCR) 序列，并选择和扩增亲和力最强的克隆(也就是下面的4)。

免疫系统中TCR和BCR库包括了很多特异性不同的克隆，这种多样性的形成机制主要包括4种：
（1）组合多样性：在免疫球蛋白V, (D), J重排的过程中，只能在众多的V, D, J基因片段中各取1个，但是每种基因片段都有很多种。以人的Ig重链V区为例，其排列组合种类可以达到40(VH) X 25(VD) X6(VJ)=6000种，以此类推，理论上IgV区基因片段加上轻重链组合后多样性可以达到1.9X1000000种；
（2）连接多样性：Ig基因片段在进行连接的时候往往有插入、缺失、替换核苷酸的情况发生，从而产生新的序列或者直接改变插入片段后密码子阅读框，这被称为连接多样性；
（3）受体编辑：有一些识别自身抗原的TCR、BCR并未被清除，而是对受体序列进行修改，从而保留克隆；
（4）体细胞高频突变：成熟的B细胞在外周淋巴器官的生发中心中进行抗体亲和力成熟的过程中，编码V区CDR部位的DNA序列发生点突变，从而增强抗体与抗原的亲和力。

以上的四种机制能够保证在大多数情况下体内都能够找到对特定病原体有反应能力的B细胞克隆（虽然不一定是最适合的），机制(1), (2), (3)也能保证在绝大多数情况下我们能有合适的T细胞克隆。

为了证明这些事件，有必要研究 BCRs 的核苷酸序列。 Visium 空间技术基于条形码转录本的 RNA 测序，这使我们得以access原始转录本并执行空间 BCR repertoire 分析。我们使用了公开可用的MiXCR⁴ (这是一种旨在从 5‘ RNA 测序数据中识别 BCR IgL 和 IgH 克隆型及其种系体细胞超突变的工具) 以及 3’ Frozen Visium 试剂盒，它使我们能够获得足够长度的 mRNA 转录物捕获大多数 IGL 和一些 IGH 序列的完整互补决定区 (CDR)3 区。通过 3 倍推荐深度（每个点 150,000 个读数，相当于每个样本 2.25 亿个读数）的测序促进了这种捕获。MiXCR 鉴定了许多独特的克隆型：总共 3,015 个 λ 轻链、3,084 个 kappa 轻链和325 重链。TLS+ 肿瘤中发现了最多的独特克隆型和总 Ig 计数。在 TLS 区域也发现了数量最多的独特轻链克隆型(Figure 3A)。B 细胞成熟是通过测量 Ig 轻链的 V 区的突变计数与映射的 V germline基因进行比对来评估的。中位 V 基因突变计数在 TLS 区域中显示低至中位水平，并且值得注意的是，在肿瘤区域中远离 TLS 的大部分是高度突变的序列 (Figure 3B)。尽管如此，在 TLS 区域测量到了全范围的突变，包括高度突变的序列，而距 TLS 一定距离的大多数 Ig 转录物富含高度突变的序列(Figures 3B and 3C)，表明体细胞高频突变发生在 TLS 中，且突变的 PC 在整个肿瘤中迁移。作者研究了47 个 ccRCC 肿瘤（包括 Visium 分析的 12 个冷冻肿瘤）的bulk 5‘ RNA-seq 中的轻链和重链突变计数，这些肿瘤使用 TLS 印记特征的中值表达被分类为 TLS high或low肿瘤。对于 VL（中位 TLS high = 12 个突变，中位 TLS low = 8 个突变，p = 0.0163）和 VH 基因（中位 TLS high = 19），中位 TLS low = 13.5 个突变，p = 0.0227），TLS high与 TLS low肿瘤的总体体细胞高频突变都显著更高 (Figure 3D)。为了确定体细胞高频突变是否伴随着克隆型选择，作者研究了bulk 5’ RNA-seq 数据的 IgH 库。TLS high的所有样本都表现出大量的总克隆型计数以及计数超过 100 次的更高比例的克隆型(Figure 3E)。事实上，30% 的 TLS high 肿瘤库被识别超过 100 次的克隆型占据，而 TLS low肿瘤中这一比例为 1% (p = 10e-7)，揭示了 TLS 高样本中持续的免疫反应。相反，TLS-low 样本显示出较少的多样性，计数较低，大多数被测量不到 10 次，除了一个肿瘤有 123 个 IgH 克隆型，只有 2 个被计数超过 100 次(Figure 3E)。

最后，为了确定扩增的 IgH 克隆型的克隆关系和位置，作者对 3’RNA-seq 空间数据进行了克隆性评估(clonality assessment)。克隆性由相同的 VH 基因家族、相同的 JH 基因和相同的 CDR3 长度以及 VH 序列之间的 CDR3 核苷酸序列的最大差异为 15% 来定义。为了可视化这些关系，作者计算了每个 VH CDR3 序列之间的 Levenshtein 距离，并使用圆形树展示了一个TLS+ 肿瘤(id: b_1)。共计 31 个具有 2 至 16 个独特成员的克隆家族被鉴定出来 (Figure 3F)。在一个家族中，一些克隆可以在多达 20 个不同的空间位置被检测到多达 80 次。IgH 克隆型在 Visiumslide 上的定位证明了同一家族的克隆型聚集在 TLS 附近并在远处稀疏迁移(Figure 3G)。一些克隆型甚至可以在距它们所在的 TLS 区域高达 3 mm 处检测到可能已经生成(Figure 3G)。为了证实这些结果，作者从配对的bulk 5’ RNA-seq 推断的克隆型中寻找从空间 3’ RNA 转录组学鉴定的克隆型的 CDR3 核苷酸序列。在肿瘤b_1上，作者鉴定出15个IGH CDR3序列的存在（共169个）(Figure 3F)。克隆家族 1 的 CDR3 序列 CATYNAGEGGRGYW 的克隆型也在bulk 50' RNA-seq 数据中发现，从而证实了分析的结果。此外，这些克隆型位于 TLS 内部和远离 TLS 的位置，表明相应 B 细胞克隆的迁移。在 TLS-low 样本中，检测到的克隆型数量非常少，限制了对 Ig 转录物的分析，也支持了肿瘤内 PC 主要在 TLS 中产生的假设。 总之，这些数据支持原位 TLS 介导的成熟，允许在肿瘤的各个区域选择、克隆扩增和传播选定的 PC。

Figure 3

4. Plasma cells disseminate from TLS along fibroblastic tracks

为了分析肿瘤内 PCs 和成纤维细胞的位置以及原位 CXCL12 的表达，作者使用了多重 IF对 FFPE 肿瘤切片进行了染色（使用多发性骨髓瘤癌基因 1 (MUM1) (IRF4) 作为 PCs的标志，使用COL1 (Col1a)作为成纤维细胞的标志）。在 TLS 区域内检测到双阳性 MUM1+ IgG+ PC 和一些 MUM1+ IgA+ PC，由连续切片上的显色 CD3/CD20 标记定义 (Figure 4A)。在这些区域观察到 COL1+/CXCL12+ 成纤维细胞与 MUM1+ PC 紧邻(Figure 4B)。此外，在远离 TLS 的地方证明了 PC 沿着成纤维细胞轨道排列，嵌入在密集的 COL1+ CXCL12+ 成纤维细胞网络中(Figure 4C, zoom 1,2)，从而证明它们在肿瘤床中的迁移。为了定量评估 PC 和成纤维细胞之间的空间关系，作者对 DAPI/MUM1/IgG/IgA IF 染色样品上的成纤维细胞核进行了 AI 检测。如下图所示，成纤维细胞核的检测映射了 COL1+ 成纤维细胞轨迹 (Figures 4D, 4E, 4H, and 4I)。绝大多数 PC 与成纤维细胞核非常接近，两个肿瘤的平均距离分别为 17.5 和 19 um (Figures 4G, K)。在 44 个肿瘤样本上测得的平均距离为 25.7 um。总而言之，这些数据展示了 Ig 和成纤维细胞转录物的共表达，以及成纤维细胞转录物和 CXCL12 的共表达，并验证了 PC 在 TLS 内的位置以及空间转录组学确定的成纤维细胞网状细胞 (FRC) 空间上的位置。值得注意的是，在被 MUM1+ IgG+ 成纤维细胞轨道包围的肿瘤巢中检测到与肿瘤细胞结合的 IgG (Figures 4F, J)。

5. TLS and Ig-producing PCs are associated with IgG antibodies bound to apoptotic tumor cells and with response to immunotherapy

为了进一步研究 TLS、肿瘤内 PC 和 Ig 染色之间的联系，作者首先分析了 TLS 成熟度。 成熟 TLS 的特点是 GC 包含一个被 T 细胞区包围的 B 细胞区，其中存在 CD4+PD1+ T 细胞、CD4+ PD1+CXCR5+ Tfh 细胞和产 CXCL13 的细胞 (Figure 5B)。 GC 区的特点是在外围检测到 CD23+ 滤泡树突细胞 (FDC)、BCL6+ CD20+ B 细胞和 PNAd+ HEV 网络(Figure 5C)。 作者研究了 103 个肿瘤中 TLS 的存在与 PC 密度之间的相关性。 观察到 TLS 的存在与 MUM1+ IgG+ 细胞和 MUM1+ IgA 细胞的密度之间存在显著关联(Figure 5D)。 作者进一步研究了 57 个 TLS+ 样本上 TLS 成熟度标记与 MUM1+IgG+ 和 MUM1+IgA+ PCs 密度的相关性。 发现含有 CD23+ FDC 网络、BCL6+ 细胞和 PNAd+ HEV 的 TLS 与 MUM1+IgG+ PC 和 MUM1+IgA+ PC 密度之间存在很强的相关性 (Figure 5E)。

Figure 5

在肿瘤巢周围检测到高密度的产生 Ig 的 PC 和在肿瘤巢中观察到 IgG 促使研究抗肿瘤抗体的存在(Figures 4F and 4J)。 值得注意的是，在 TLS+ 肿瘤中观察到了CAIX+肿瘤细胞膜和anti-human IgG连接的强信号，在TLS-肿瘤中则没有观察到(Figure 6A)。 随后对 103 个肿瘤的量化显示 IgG 阳性率很高，与 TLS- 肿瘤相比，TLS+ 中的肿瘤细胞高达 100%（中位数分别为 70% 和 30%，p = 0.0046）(Figure 6B; Table S3)。 在 TLS+ 和 TLS- 肿瘤中均观察到弱 IgA 标记 (Figure 6F; Table S3)。 此外，发现肿瘤细胞上的 IgG 标记与 MUM1+ IgG+ PC 的肿瘤浸润之间存在显著关联（MUM1+IgG+ 高肿瘤的中位 IgG 标记 = 80%，MUM1+IgG+ 低肿瘤的中位 IgG 标记 = 40%，p = 0.000195） (Figure 6C)，IgA 标记则非常低(Figure 6D)。

为了揭示肿瘤结合 IgG 抗体的潜在功能，作者使用检测cleaved caspase 3的抗体检测了肿瘤细胞中发生的细胞凋亡迹象，通过其典型的大细胞核和透明细胞表型鉴定。下图展示了在 一个 TLS+ 和一个 TLS- 肿瘤中cleaved caspase 3的染色情况。 在 IgG 染色高于 60%（这是区分两个肿瘤群的最佳平均值）的肿瘤中，cleaved caspase 3+ 肿瘤细胞的密度显着高于 IgG+ 肿瘤细胞低于 60% 的肿瘤（中位数：12.7 个细胞/ mm2 和 7.2 个细胞/mm2，p = 0.0255）(Figure 6F)。

作者随后关注了可能在诱导肿瘤细胞凋亡中起作用的机制。由于巨噬细胞和 NK 细胞是抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 的主要效应物，作者分别评估了 76 和 98 个肿瘤上 CD68+ 巨噬细胞和 NKp46+NK 细胞的总密度，发现它们喝cleaved caspase-3+ 肿瘤细胞密度没有相关性。然而，发现具有大量凋亡细胞和高百分比 IgG 染色肿瘤细胞的肿瘤比具有大量凋亡细胞但低百分比 IgG 染色肿瘤细胞的肿瘤更容易被 CD68+ 巨噬细胞浸润（p = 0.0054 ）(Figure S6A)。Proximity assessment证明 14 个肿瘤上 CD68+ 巨噬细胞和cleaved caspase 3+ 肿瘤细胞呈正相关，凋亡细胞数量多，IgG 染色肿瘤细胞百分比高(Figure S6B)。NK 细胞的密度低于巨噬细胞，并没有表现出这种相关性(Figures S6C and S6D)。此外，作者发现 13.6% 的凋亡肿瘤细胞位于小于 25 mm 的巨噬细胞处，而没有观察到 NK 细胞和凋亡肿瘤细胞之间的紧密接近（中位数 = 0.5%）(Fig- ure S6E)。Figure 6G 展示了CD68+巨噬细胞和IgG-stained/cleaved caspase 3+肿瘤细胞之间的close proximity。

为了评估 IgG 肿瘤染色对 ICI 治疗患者的影响，我们评估了来自 NI 治疗患者的 35 个肿瘤和来自 Nivolumab 治疗患者的 16 个肿瘤（一名 Nivolumab 治疗患者的 IgG 肿瘤染色不可评估，一名患者缺少临床信息） 。作者选择平均 IgG 肿瘤染色 (60%) 作为截止值，因为它区分了最好的两个肿瘤群体 (Figure 6H)。对于 NI 治疗的患者，证明了 IgG 肿瘤细胞标记高于平均值的患者的治疗反应与 62% 的客观反应（OR：完全和部分反应）之间存在显著关联，而 IgG 肿瘤细胞标记低于平均值的患者为 18% OR (p = 0.0384)，以及与低 IgG 肿瘤细胞染色相比，高 IgG 肿瘤细胞染色患者的 PFS 显著延长（中位 PFS = 16.3 个月对 6.4 个月，p = 0.039）(Figure 6I)。仅接受 Nivolumab 治疗的患者队列太小，无法进行统计分析。然而，在接受 ICI 治疗的 51 名患者中，无论是单用 Nivolumab 还是 NI，对于肿瘤染色高的患者（未达到与 6.4 个月，p = 0.019）相比，观察到 PFS 显著延长，并且 OR 数量呈增加趋势（58% 对 32%）(Figure 6J)。

Figure 6

Figure S6

Reference

1. Becht, E., Giraldo, N.A., Lacroix, L., Buttard, B., Elarouci, N., Petitprez, F., Selves, J., Laurent-Puig, P., Saute`s-Fridman, C., Fridman, W.H., et al. (2016a). Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression. Genome Biol 17, 218.
2. Cable, D.M., Murray, E., Zou, L.S., Goeva, A., Macosko, E.Z., Chen, F., and Irizarry, R.A. (2021). Robust decomposition of cell type mixtures in spatial transcriptomics. Nat. Biotechnol. https://doi.org/10.1038/s41587-021-00830-w.
3. King, H.W., Orban, N., Riches, J.C., Clear, A.J., Warnes, G., Teichmann, S.A., and James, L.K. (2021). Single-cell analysis of human B cell maturation predicts how antibody class switching shapes selection dynamics. Sci. Immunol. 6, eabe6291.
4. Bolotin, D.A., Poslavsky, S., Davydov, A.N., Frenkel, F.E., Fanchi, L., Zolotareva, O.I., Hemmers, S., Putintseva, E.V., Obraztsova, A.S., Shugay, M., et al. (2017). Antigen receptor repertoire profiling from RNA-seq data. Nat. Biotechnol. 35, 908–911.