Cancer Cell | 抗PD-1辅助治疗后胰腺癌肿瘤微环境变化的多组学分析

原创 huacishu 图灵基因 2022-11-03 10:40 发表于江苏

收录于合集#前沿生物大数据分析

撰文：huacishu

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亮点：

1、作者对PDAC配对治疗前和治疗后肿瘤生物样本队列进行分析，以阐明新辅助治疗中抗PD-1治疗敏感性和耐药性的机制；

2、本研究还整合了多组学分析，以全面定义抗PD-1 ICI治疗后PDAC TME内免疫亚群的变化；

3、作者指出这些发现为PDAC中PD-1调节的免疫途径提供了见解，也为包括TAN调节剂和T细胞激活剂在内的更有效的治疗组合提供了有用的信息。

美国约翰·霍普金斯大学医学院 Lei Zheng教授课题组在国际知名期刊Cancer Cell在线发表题为“Multi-omic analyses of changes in the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma following neoadjuvant treatment with anti-PD-1 therapy”的论文。成功的胰腺导管腺癌（PDAC）免疫治疗需要优化和维持激活的效应T细胞（Teff）。作者应用多组学分析对治疗前和治疗后的PDAC标本进行配对，以揭示敏感性和耐药性机制，这些标本是在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子分泌的PDAC疫苗（GVAX）±nivolumab（抗程序性细胞死亡蛋白1[PD-1]）的平台新辅助研究中收集的。

结果表明，GVAX诱导的三级淋巴聚集物成为对GVAX+nivolumab的免疫调节位点。GVAX+nivolumab治疗后肿瘤相关中性粒细胞（TAN）的密度越高，总体生存率（OS）越低。表达CD137的T细胞增加与细胞毒性Teff特征相关，并与OS增加相关。体细胞和单细胞RNA测序发现，nivolumab改变CD4+ T细胞趋化信号，CD137的CD8+ T细胞表达是T细胞活化所必需的。这些发现为PDAC中PD-1调节的免疫途径提供了见解，也为包括TAN调节剂和T细胞激活剂在内的更有效的治疗组合提供信息。

免疫检查点抑制剂（ICI）是癌症治疗学的重大突破；然而，只有不到20%的癌症患者对ICI作为单一药物有反应。胰腺导管腺癌（PDAC）属于原型、免疫原性“冷”肿瘤，因为它们缺乏效应T细胞（Teffs）的自然浸润，而效应T细胞是对ICI有反应的细胞。为了将PDAC转化为ICI反应性肿瘤，需要有效的免疫治疗策略来提高抗原性、增强Teff功能、以及克服肿瘤微环境（TME）中的T细胞排斥和免疫抑制信号。

作者一直在从事癌症疫苗在诱导能渗透PDAC的Teff方面的工作。结果发现，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分泌的异源基因PDAC疫苗（GVAX）可以在一次接种后仅2周诱导PDAC中形成淋巴聚集物（LA）。

此外，程序性死亡配体1（PD-L1）的表达在这些淋巴聚集物内的肿瘤上皮细胞和髓系细胞上都被诱导，这表明疫苗治疗可能会启动PDAC对ICI的反应。这些研究表明，有可能将PDAC转化为免疫反应性肿瘤。然而，临床反应率仍然很低。因此，当前的挑战是在复杂的PDAC TME中识别额外的免疫调节信号，这些信号需要进一步修饰以有效增强Teff功能，并优化和维持最有效的Teff的激活。

PDAC TME的分析主要来自于储存的生物样本收集，而不是前瞻性免疫治疗临床试验。作者报告了一项新辅助平台研究的初始数据分析，在该研究中，根据生成的数据继续向先前治疗组中测试的药物添加免疫剂。从研究中收集的免疫治疗前和免疫治疗后配对肿瘤生物样本可用于多组学分析TME随治疗的变化以及这些TME变化与临床结果的相关性。

Nivolumab增强疫苗诱导的CD4+和CD8+T淋巴细胞，并减少治疗后PDAC肿瘤中CD4+PD-1+和CD4+PD-1+T淋巴细胞的浸润

为了研究用GVAX或GVAX+nivolumab进行新辅助免疫治疗后PDAC中肿瘤浸润免疫细胞的变化，采用了顺序染色和剥离多重免疫组织化学（mIHC）技术。从34名患者中采集标本。在治疗后手术切除的肿瘤区域内选择感兴趣区域（ROI），这些肿瘤区域包含淋巴聚集物，并将其分为淋巴聚集物区域和淋巴聚集物以外的肿瘤区域（指定为非淋巴聚集物肿瘤区域）（图1A–1C）。

从每个治疗后肿瘤中选择肿瘤区域中至少三个ROI，每个ROI包含至少一个淋巴聚集物。另外还选择ROI，以覆盖同一治疗前活检的至少三个不同的肿瘤核心（图1D、1E）。标记物的组合用于识别每个免疫亚型。每个免疫细胞亚型的密度计算为ROI内所有细胞的百分比。尽管这种比较可能受到小样本量的限制，两个治疗组治疗前活检中免疫细胞密度的比较没有显示出显著差异。

因为治疗前活检标本不含淋巴聚集物，作者比较了匹配的治疗前和治疗后肿瘤标本中的非淋巴聚集物肿瘤区域，以评估治疗引起的变化。与两个治疗组中每个患者的治疗前活检相比，在治疗后肿瘤中，非淋巴聚集物肿瘤区域的许多免疫细胞亚群增加（图1F和1G）。这些结果表明，疫苗治疗不仅诱导淋巴聚集的形成，而且诱导免疫细胞的瘤内浸润。

此外，与A组相比，我们观察到B组治疗后淋巴细胞聚集中CD4+和CD8+T细胞的密度明显更高（图2A）。这一结果表明，如果联合接种疫苗诱导了T细胞，ICI治疗可增强Teff浸润。此外，来自B组肿瘤的淋巴细胞聚集中治疗后CD4+程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）+和CD8+PD-1+T细胞的密度显著降低（图2A），这可能是由于对nivolumab的免疫反应。与A组相比，B组治疗的患者非淋巴细胞聚集肿瘤区域的Th17细胞显著增加（图2B）。

与单独接种疫苗相比，联合接种疫苗+nivolumab可增加多种瘤内CD8+T细胞群

为了了解ICI在PDAC中引发的反应和抗性机制，作者检查了T细胞和髓系细胞的每种亚型及其与OS的相关性。A组（而非B组）治疗前活检中CD8+GZMB+T细胞的较高浸润与存活率的提高有关（图2C）。有趣的是，在治疗后淋巴细胞聚集（图2D），而不是非淋巴细胞聚集肿瘤区域（图2E），一般CD8+T细胞密度较低，这可能是由于CD8+PD-1+T细胞亚型的减少，与B组的OS显著增加有关。

接下来，比较了可用的治疗前活检和匹配的治疗后非淋巴细胞聚集肿瘤区域中CD8+和CD8+GZMB+T细胞浸润的变化，并将这些数据与OS进行了关联（图2F）。在三名OS<2岁的A组患者中，CD8+GZMB+T细胞浸润在统计学上显著增加（图2F）。

接着检查了CD3+CD8+CD137+ T细胞的密度，并观察到治疗后淋巴细胞聚集中CD3+CD8+CD137+ T细胞的较高密度与两个治疗组的OS>2年相关（图2G）。进一步研究了淋巴细胞聚集中的CD137+T细胞亚群是否与细胞毒性Teff特征相关，并发现治疗后淋巴细胞聚集中CD3+CD8+CD137+ T细胞的较高密度与CD8+GZMB+ T细胞的较高浓度显著相关（图2H）。

在接受疫苗+nivolumab治疗的患者中，Th1:Th2 CD4+T细胞比率和Th17细胞密度的增加与OS改善相关

接下来，作者评估了治疗后淋巴细胞聚集和非淋巴细胞聚集肿瘤区域中CD4+ T细胞的浸润，并将其与OS相关。CD4+ T细胞的总密度和特定CD4+ T细胞亚型（包括Th1、Th2、Th17和Tregs）的密度与任一组的OS均无显著相关性（图2I–2N）。还观察到，与OS<2年的患者相比，OS>2年患者淋巴细胞聚集的Th17细胞有增加的趋势（图2N），这表明抗PD-1治疗在OS改善的患者中扩增了Th17细胞（图2O）。总之，治疗后肿瘤中的Th1:Th2比率和Th17密度可以预测GVAX和抗PD-1抗体联合治疗后更长的OS。

抗PD-1治疗减少了与OS改善相关的淋巴细胞聚集驻留的PD-1+CD4+和CD8+ T细胞，但与单独的疫苗治疗相比，对EOMES+ T细胞群没有不同的影响

接下来检查了抗PD-1治疗相关的淋巴细胞聚集中CD8+PD-1+和CD4+PD-1+ T细胞的减少是否与患者存活相关。作者发现，与OS＜2年的患者相比，OS＞2年的淋巴细胞聚集患者的CD8+PD-1+和CD4+PD-1+ T细胞仅在B组显著减少，而在A组则没有，这表明CD8+PD-1+和CD 4+PD-1+ T细胞是抗PD-1治疗的潜在的预后预测因子（图2P和2Q）。

相反，A组和B组OS>2岁的患者中，CD8+ T细胞的Eomesodermin（EOMES）+亚群显著减少（图2R）。结果支持治疗后淋巴细胞聚集中CD8+EOMES+ T细胞的耗尽表型作为GVAX或GVAX+nivolumab治疗后的潜在耐药机制。

TAM和TAN人群的变化与疫苗+抗PD-1治疗后的OS相关

作者还研究了疫苗加抗PD-1治疗后髓系细胞群的变化。在治疗前肿瘤活检中，没有观察到OS与M1样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、M2样TAM或PD-L1+TAM的密度之间的任何关联。然而，治疗后淋巴细胞聚集中M2样TAM的密度较高与A和B组的OS相关性较差。此外，M1样与M2样TAMs的比例较高与OS改善相关（图3A）。相反，非淋巴细胞聚集肿瘤区域TAM密度的变化与OS无关（图3B），证明淋巴细胞聚集是PDAC肿瘤中免疫调节的重要位点。

然后，检测了CD3-CD66b+标记的肿瘤相关中性粒细胞（TANs），发现在治疗前活检中，TANs的密度高于TAMs，这表明中性粒细胞可能比TAMs在调节PDAC TMEs的免疫方面发挥更显著的作用。在GVAX+nivolumab治疗的患者中，治疗前活检中发现的TAN密度较高与OS显著降低相关（图3E–3H），这一发现支持了这种可能性。

接下来，作者检验了治疗后淋巴细胞聚集中TAN的变化与不同T细胞功能相关的假设。作者发现，治疗后淋巴细胞聚集中TAN的较高密度与肿瘤浸润CD4+PD-1+T细胞的较高密度显著相关，并且与整个肿瘤区域中CD8+PD-1+ T细胞的高密度（图3I–3K）显著相关。对T细胞耗竭标记物进行了免疫组织化学（IHC）染色，发现治疗后淋巴细胞聚集中TAN的较高密度与肿瘤浸润LAG3+ T细胞的较高密度相关（图3L）。TIM3+和EOMES+T细胞变化（图3M）与TAN密度无关；因此，调节TANs可以通过LAG3促进耗尽的T细胞群的再生。

为了确定TANs的潜在治疗靶点，作者通过IHC检测了白介素(IL)-8RB/CXC趋化因子受体2（CXCR2）在TANs上的表达，结果表明，大多数CD66b+TAN表达CXCR2，并且CD66b+TAN负责治疗后肿瘤中大多数CXCR2的表达（图3N），这支持了基于IL-8/CXCR2的免疫治疗在PDAC中靶向TAN的观点。

GVAX+nivolumab治疗后，肿瘤免疫细胞空间关系受CD8+GZMB+ T细胞和非淋巴聚集性肿瘤区域的TAN的影响

为了发挥免疫效应或免疫抑制功能，免疫细胞需要在空间上接近其靶细胞。因此，作者对上述mIHC图像的ROI进行再处理（图4A），并测量由EpCAM标记的上皮肿瘤细胞、CD8+T细胞和由集落刺激因子1受体（CSF1R）标记的髓系细胞之间的距离（图4B）。淋巴细胞聚集物中CD8+ T细胞的密度没有显著改变肿瘤细胞、CD8+ T细胞和CSF1R+髓系细胞之间的距离（图4C）。

有趣的是，淋巴细胞聚集中CD8+PD-1+ T细胞的较低密度似乎与抗PD-1治疗和更长的OS相关（图2A和2Q），与PD-1-CD8+ T细胞和肿瘤细胞之间的距离更长相关（图4D）。在接受GVAX+nivolumab治疗的患者的肿瘤中，无论其PD-1表达如何，在淋巴细胞聚集中CD8+GZMB+ T细胞密度较高或较低的肿瘤中CD8+ T细胞与肿瘤细胞之间的距离显著增加（图4E）。因此，淋淋巴细胞聚集中的CD8+GZMB+ T细胞可能影响淋巴细胞聚集的免疫调节作用，但不是直接杀死肿瘤的效应器。

非淋巴聚集性肿瘤区域中一般CD8+ T细胞的密度也与CSF1R+髓细胞和肿瘤细胞之间的距离相关（图4F和4G）。在接受GVAX+nivolumab治疗的患者的肿瘤中，在非淋巴细胞聚集肿瘤区域，CD8+GZMB+ T细胞密度较高或较低的患者中，CD8+T细胞与肿瘤细胞之间的距离明显缩短（图4H）。这一结果说明非淋巴聚集性肿瘤区域中的抗PD-1处理的CD8+GZMB+ T细胞促进了Teff进入肿瘤细胞。

TIL的RNA-seq分析表明，nivolumab治疗后原始CD4+ T细胞减少，CD8+ TCR克隆扩增与更长的OS时间相关

接下来，对治疗后分离的肿瘤浸润白细胞（TIL）进行了全转录组RNA测序（RNA-seq），该分析估计了每个样本中22种免疫细胞亚型的比例（图5A）。通过RNA-seq数据的CIBERSORTx分析估计的细胞类型组成与基于流式细胞术的分类一致。同时也比较了治疗组和OS组细胞丰度的变化，这些变化与每个标记蛋白的分类细胞亚型一致。

比较试验组之间CIBERSORTx估计的免疫细胞亚型的细胞丰度，观察到B组的原始CD4+T细胞无明显减少（图5B），但CD8+T细胞有统计学意义的减少（图5A）。

根据大量RNA序列数据预测T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）序列的方法可以进一步分析每种细胞类型中癌症特异性功能活性。当比较两组时，在每次治疗后，在肿瘤内CD4+T细胞、CD8+T细胞或B细胞中未观察到克隆性的显著变化（图5E–5G）。

然而，在OS>2年的肿瘤中，CD8+T细胞克隆性显著增加，但CD4+T细胞或B细胞克隆性没有显著增加（图5H–5J）。这些结果表明，在GVAX中加入抗PD-1治疗可提高CD4+T细胞的免疫原性活性，但不能提高CD8+T细胞中的免疫原活性，而CD8+T细胞的克隆扩增和细胞毒性活性是改善生存结果所必需的。

nivolumab治疗中CD4+T细胞趋化因子信号转导的转录变化将中性粒细胞脱颗粒和随后的ECM重塑与活化的CD8+T细胞运动和功能的抑制联系起来

为了进一步表征与较长OS相关的细胞变化机制的分子途径，对每种TIL亚型进行了差异表达分析（图6A-6F），并鉴定了与OS和治疗相关的显著差异表达基因。尽管由于具有足够RNA质量的样本太少，没有通过OS在CD11b+和CD19+细胞中进行差异表达分析，但分析支持了更长的OS与泛素依赖性蛋白水解途径、CD4+和CD8+T细胞中肿瘤坏死因子（TNF）信号传导的上调之间的关联，以及CD8+T细胞中增强的功能信号传导（图6A和6B）。

其他变化归因于B组的抗PD-1治疗。这些变化包括CD4+T细胞中CCR7的统计学显著下调（图6C）；BIRC2，其已被证明可减少与ICI治疗相关的肿瘤内CD8+T和NK细胞浸润；CRKL，其控制由外来抗原诱导的Treg的产生；IFITM1，它是干扰素（IFN）诱导的抗病毒蛋白；TNFSF8是TNF配体家族中的细胞因子。值得注意的是，在多种细胞因子/趋化因子信号通路的上调中观察到了增强的免疫反应，如REACTOME通路，包括趋化因子受体结合趋化因子（图6G）。

此外，观察到细胞因子CCL13的上调（图6C），其吸引促炎性髓样细胞。由于抗PD-1治疗，细胞因子/趋化因子信号的改变可能会进一步影响TME中其他免疫细胞的功能。B组中与髓系细胞和淋巴细胞趋化性相关的多个GOBP通路的显著上调支持了这一点（图6H）。

总之，这些结果表明，抗PD-1治疗通过调节趋化因子/细胞因子信号通路激活CD4+T细胞。

与CD4+T细胞相比，在CD8+细胞中观察到与抗PD-1治疗相关的免疫应答基因变化较少（图6D）。

然而，观察到标志性上皮-间充质转化（EMT）途径在统计学上显著增加；REACTOME途径，包括ECM组织、胶原降解和ECM蛋白聚糖；GOBP途径，包括胶原蛋白代谢过程和补体活化；以及ECM基质结构成分的GOMF途径（图6I）。这些途径的上调表明，抗PD-1治疗诱导了ECM对CD8+T细胞运输的调节，而不是直接激活CD8+T细胞。

总之，这些分析表明，抗PD-1治疗诱导了多种细胞因子和趋化因子信号的改变，这些信号激活CD4+T细胞，并可能通过改变ECM来诱导骨髓细胞运输和中性粒细胞脱颗粒，从而阻碍免疫效应细胞（包括CD8+T细胞和B细胞）的运动和活化。

未经处理的PDAC的单细胞分析显示，CD137（TNFRSF9）hi CD8+T细胞通过IFN-g受体配体向中性粒细胞发出信号，CD137（TNFRSF9）hi效应器CD8+T细胞亚群表现出增强的TNF-a应答

作者希望进一步挖掘与这些T细胞反应相关的额外分子变化的RNA-seq数据。因此，利用先前报道的17种未经治疗的原发性PDAC肿瘤的25903细胞的单细胞图谱来评估CD137（由TNFRSF9编码）在T细胞亚型中的表达分布，以及与CD8+CD137+T细胞浸润直接相关的TME变化。

标准化细胞亚型鉴定了该图谱中的多种免疫细胞亚型（图7A）。使用TNFRSF9的表达值将T细胞分类为TNFRSF9hi或TNFRSF7lo（图7B）。在T细胞群中，Tregs在图谱中PDAC中表达TNFRSF9的细胞的平均比例最大，其次是效应CD8+T细胞和CD8+T细胞（图7C）。

TNFRSF9hi Tregs在19个基因组中显著富集，炎症途径如通过核因子kB（NF-kB）的TNF-a信号、IL-2、STAT5信号、炎症反应和凋亡是这些细胞中最富集的基因组（图7D）。效应CD8+TNFRSF9hi T细胞通过NF-kB、EMT和凋亡途径显著富集了TNF-a信号传导，而效应CD8+TNFRSF7lo T细胞富集了包括IFN-g反应、氧化磷酸化和IFN-a反应在内的途径，相对于TNFRSF9 hi细胞（图7E）。

这些结果表明，效应CD8+T细胞中TNFRSF9表达的增加可能导致炎症反应程序转变为TNF反应状态，在炎症反应程序中，TNFRSF 9的低表达与IFN反应相关，IFN反应对Teff的细胞毒性很重要，而TNF反应状态与TNFRSF7的高表达相关。

讨论

作者对PDAC配对治疗前和治疗后肿瘤生物样本队列进行分析，以阐明新辅助治疗中抗PD-1治疗敏感性和耐药性的机制。本研究还整合了多组学分析，以全面定义抗PD-1 ICI治疗后PDAC TME内免疫亚群的变化。尽管样本量仍然很小，但多组学方法揭示了免疫调节信号通路，这些通路可能成为正在进行的平台新辅助研究中PD-1阻断抗体联合免疫疗法测试的新治疗靶点。

对单细胞RNA序列图谱的分析证实了这些免疫亚群信号通路在独立队列中的存在，进一步支持了在未来试验中进一步评估这些特定通路的必要性。因此，这项平台研究为快速了解提高免疫力的机制和抵抗性的代偿机制提供了机会，目的是确定最有效的组合，以快速推进治疗癌症的临床开发。

教授介绍

Lei Zheng教授被视为世界顶级胰腺癌临床专家之一，他是国际公认的胰腺癌肿瘤微环境、胰腺癌小鼠模型和联合免疫疗法临床前研究专家。他是约翰·霍普金斯医学院胰腺癌精准医学卓越中心项目的联合主任。Zheng教授获得北京大学医学学士学位。他在北京协和医学院获得医学博士学位，在德克萨斯大学健康科学中心获得分子医学博士学位。他还完成了德克萨斯大学健康科学中心的分子医学博士后研究。Zheng教授于2009年加入约翰·霍普金斯大学医学院。他的研究兴趣包括胰腺癌生物学和翻译研究；转化免疫学和癌症免疫治疗；以及肿瘤微环境。

参考文献

Li et al., Multi-omic analyses of changes in the tumor microenvironment of pancreatic adenocarcinoma following neoadjuvant treatment with anti-PD-1 therapy, Cancer Cell (2022), https://doi.org/10.1016/j.ccell.2022.10.001