老年骨质疏松症主要由成骨细胞功能衰减引起，进而导致骨量减少和骨重塑过程破坏。目前许多研究表明m6A修饰在骨质疏松症的调控中发挥着重要作用，但大多数研究集中在骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的作用上，而m6A对成骨细胞的直接调控机制尚不清楚。

兰州大学第二医院骨科夏亚一教授和耿彬教授合作，在老年骨质疏松症患者中揭示了m6A修饰和甲基转移酶样3（METTL3）表达降低。进一步体外实验表明，METTL3抑制了成骨细胞衰老，而成骨细胞功能障碍会影响骨代谢平衡。随后MeRIP-seq和mRNA-seq联合揭示了METTL3调控Hspa1a转录本的稳定性。在METTL3抑制成骨细胞衰老过程中，YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2（YTHDF2）延缓了Hspa1a mRNA的衰减。METTL3在小鼠成骨细胞中特异性过表达，进一步证实METTL3可以抑制老年骨质疏松症的进展。相关研究成果以“METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging”为题发表在《cell death discovery》期刊上。

标题：METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging（METTL3介导的m6A修饰可增加Hspa1a稳定性以抑制成骨细胞衰老）

时间：2024.3.27

期刊：cell death discovery

影响因子：IF 7/ 2区

实验方法：MeRIP-seq、mRNA-seq、Western blot、qRT-PCR、免疫荧光和组织学染色等

研究摘要：

本研究揭示了老年骨质疏松症的进展与m6A修饰和METTL3下调密切相关。METTL3过表达可以抑制成骨细胞的衰老。甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）揭示了METTL3通过上调Hspa1a mRNA的稳定性来抑制成骨细胞衰老。此外，结果表明METTL3通过m6A修饰增强Hspa1a

mRNA的稳定性来调控成骨细胞衰老。YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2（YTHDF2）参与METTL3介导的m6A修饰过程中Hspa1a mRNA的稳定。从机制上讲，METTL3以YTHDF2依赖性方式增加Hspa1a

mRNA的稳定性，以抑制成骨细胞衰老。本研究结果证实了METTL3在成骨细胞衰老中的重要作用，并表明METTL3可能是老年骨质疏松症的潜在治疗靶点。

结果图形：

（1）老年骨质疏松症中m6A修饰减少

为了研究与年龄相关的骨质流失与 m6A 修饰之间的关系，进行比色法检测骨组织中的m6A水平。检测结果在老年骨质疏松症患者的骨组织中观察到m6A修饰水平显著降低（图1）。由于m6A修饰主要受甲基转移酶和去甲基化酶调控，因此在骨组织中检测METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1的mRNA水平。

图1：老年骨质疏松症患者样本中m6A水平变化以及METTL3等基因和蛋白表达情况。 a. 老年骨质疏松症患者的骨样本进行了m6A水平的比色评估。（n=10） b. 老年骨质疏松症患者样本进行METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1表达的qRT-PCR分析。（n=10） c. 小鼠骨质疏松症骨组织进行m6A水平的比色评估。（n=6） d. western blot分析样本中的METTL3蛋白水平。（n=6） e. H2O2诱导的MC3T3-E1细胞衰老过程中m6A水平的比色分析（n=3）。 f. 通过β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞（n=3）。 g. 透射电子显微镜分析线粒体形态（n=3）。 h. western blot分析样本中METTL3蛋白水平（n=3）。

（2）METTL3 抑制体外成骨细胞衰老

在衰老过程中，骨微环境中的各种细胞类型都会经历衰老，导致骨形成减少和骨的负平衡。为了研究成骨细胞衰老是否归因于m6A修饰减少和METTL3表达降低，建立了MC3T3-E1-shMETTL3，并从C57/BL6小鼠的原代成骨细胞中敲低了METTL3。

图2：成骨细胞衰老与METTL3促进的m6A变化密切相关。 a. 对METTL3基因敲除后的MC3T3-E1细胞和原代成骨细胞进行m6A水平的比色评估（n=3）。 b. β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞（n=3）。 c. 使用免疫荧光鉴定METTL3和p21的定位和表达，bar = 20 μm（n = 3）。 d. JC-1染色分析线粒体膜电位，bar =10μm（n = 3）。 e. Western Blot检测METTL3、p53、CDK4和p21蛋白水平（n = 3）。

（3）成骨细胞功能对体外骨微环境代谢的影响

图3：成骨细胞功能影响骨微环境。 a. 免疫荧光实验分析METTL3和p21的表达，bar = 20 μm（n = 3）。 b. β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞（n=3）。 c. 使用JC-1染色来评估线粒体膜电位，bar =10μm（n = 3）。 d. β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞（n = 3）。 e. EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）实验评估细胞增殖，bar =50μm（n = 3）。

（4）MeRIP-seq揭示METTL3调控Hspa1a稳定性

为研究METTL3在调控成骨细胞衰老中的潜在分子机制，研究人员在MC3T3-E1细胞中激活METTL3后，进行了MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀测序）和mRNA-seq（mRNA测序）。实验结果表明，在MC3T3-E1细胞中鉴定的m6A位点在“GGAC”序列中富集（图4a），大部分m6A位点位于编码序列（CDS）和3'非翻译区（3'UTR）。Metagene分析显示m6A位点主要位于终止密码子附近。MeRIP-seq和mRNA-seq分析鉴定出13个共有显著基因。验证了7个显著上调的潜在靶标，qRT-PCR结果显示Nr4a3和Hspa1a上调更为显著（图4b）。在Hspa1a终止密码子附近发现m6A峰的高丰度和特异性，表明Hspa1a可能是成骨细胞衰老的关键调控因子（图4c）。通过SRAMP数据库预测揭示Hspa1a mRNA中的多个高度可靠的m6A修饰位点。在METTL3沉默的MC3T3-E1细胞系和原代成骨细胞中，Hspa1a蛋白表达水平显著下调（图4d）。免疫荧光结果也表明在METTL3沉默后Hspa1a表达下调（图4e）。RIP-qPCR结果证实Hspa1a mRNA能直接与METTL3蛋白结合（图4f）。MeRIP-qPCR验证了在METTL3沉默的细胞系中Hspa1a mRNA的m6A修饰水平显著降低（图4g）。随后进行RNA稳定性实验以分析METTL3介导的m6A修饰对Hspa1a表达调控作用机制。METTL3沉默后，Hspa1a mRNA的衰减速度显著快于对照组（图4h）。这些结果表明METTL3增加了Hspa1a mRNA的稳定性并减少了其衰减。通过以上实验，研究人员揭示了METTL3通过m6A修饰正向调控Hspa1a mRNA稳定性的机制，并揭示METTL3可能通过这一机制抑制成骨细胞衰老。

图4： MeRIP-seq揭示METTL3调控Hspa1a稳定性。 a. MeRIP-Seq分析显示，成骨细胞“GGAC”motif在m6A位点富集。 b. 对7个显著上调的潜在靶标进行qRT-PCR分析（n=3）。 c. Hspa1a终止密码子附近的m6A峰具有高丰度和特异性。 d. Western Blot分析METTL3沉默后Hspa1a蛋白水平（n=3）。 e. 免疫荧光检测Hspa1a表达，bar=20μm（n=3）。 f. RIP-qPCR研究Hspa1a mRNA-METTL3蛋白的直接互作（n=3）。 g. MeRIP-qPCR分析Hspa1a m6A修饰（n=3） h. qRT-PCR检测放线菌素D诱导后的mRNA水平以分析降解情况（n=3）。

（5）METTL3介导的m6A修饰以YTHDF2依赖性方式调控Hspa1a mRNA衰变

图5：METTL3介导的m6A修饰以YTHDF2依赖性方式调控Hspa1a mRNA衰变。 a. JC-1染色检测线粒体膜电位，bar=10μm（n=3）。 b. β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞（n=3）。 c. 免疫荧光检测Hspa1a和p21表达，bar=20μm（n=3）。 d. Western Blot检测METTL3、Hspa1a、YTHDF2和IGF2BP1蛋白水平（n=3）。 e. RIP-qPCR实验鉴定与Hspa1a mRNA互作的m6A依赖性蛋白（n=3）。

（6）靶向成骨细胞中的METTL3可抑制老年性骨质疏松症进展

图6：靶向成骨细胞中的METTL3可抑制老年小鼠骨质疏松症。 a. 小鼠分组和干预措施示意图（n=6）。 b. c. f. 通过组织学实验（HE染色、Von Kossa染色和calcein染色，bar=200 μm）来分析小鼠股骨远端情况（每组n=3）。 d. 对小鼠股骨远端进行定量micro-CT分析（每组n=3），以评估骨密度和骨微结构的变化。 e. 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中骨代谢标志物水平（每组n=3）。 g.利用免疫组化分析骨组织中METTL3、Hspa1a、p53和p21水平（每组n=3），以评估在骨质疏松症发展中的作用。 h. METTL3介导的m6A修饰以YTHDF2依赖性方式调控Hspa1a mRNA衰减，且METTL3通过抑制成骨细胞衰老来调控老年骨质疏松症进展的示意图，bar=50 μm。

参考文献：

WangY, Chen Y, Xiao H, Liu Z, Liu X, Feng Z, Sheng X, Peng B, Ren X, Xu L, Teng F,Yi Z, Niu Y, Xiang D, Xia Y, Geng B. METTL3-mediated m6A modification increasesHspa1a stability to inhibit osteoblast aging. Cell Death Discov. 2024 Mar27;10(1):155. pii: 10.1038/s41420-024-01925-4. doi: 10.1038/s41420-024-01925-4.PubMed PMID: 38538596.