卵巢癌（Ovarian cancer，OC）是影响女性生殖系统的三种常见恶性肿瘤之一。转录因子Forkhead box蛋白O1（FoxO1），又称forkhead横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma）转录因子，属于Forkhead box O（FoxO）转录因子家族，处于肿瘤分子调控网络的中心。大量研究表明，FoxO1失衡与肿瘤发展、侵袭和转移的病理过程密切相关。然而，关于FoxO1在OC中的作用没有统一的结论。
2024年2月25日，医药生物技术国家重点实验室（南京大学）窦环博士团队以“FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6A modification of SMC4”为题在《Cancer Science》杂志发表研究论文，讨论了FoxO1在OC中的作用和分子机制，表明了FoxO1驱动的4号染色体结构维持（structural maintenance of chromosome 4，SMC4）表达对OC发生至关重要，本研究可能为OC患者的早期诊断和靶向治疗提供重要启示。
标题：FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6A modification of SMC4（FoxO1增加SMC4转录和METTL14介导m6A修饰以促进卵巢癌发展）
时间：2024-2-25
期刊：Cancer Science
影响因子：IF 5.7
技术平台：ChIP-seq等
研究摘要
转录因子FoxO1与卵巢癌（OC）发生发展密切相关，但其作用和分子机制尚不清楚。本研究分析结果解释了FoxO1在OC患者的临床样本中高表达，且与预后不良显著相关。FoxO1敲低在体外和体内抑制OC细胞增殖。ChIP-seq结合GEPIA2和Kaplan-Meier数据库分析表明，4号染色体的结构维持（SMC4）是FoxO1的下游靶标，FoxO1通过与其-1400/-1390 bp启动子结合来促进SMC4转录。SMC4高表达显著阻断了FoxO1敲低的肿瘤抑制作用。此外，FoxO1通过转录激活甲基转移酶样14（METTL14）并增加其编码序列区域上的SMC4 m6A甲基化来增加SMC4 mRNA丰度。癌症基因组图谱（TCGA）数据集分析证实了OC中FoxO1、SMC4和METTL14表达之间存在显著正相关。总之，这项研究揭示了FoxO1调控SMC4的分子机制，并在OC发生过程中FoxO1/METTL14/SMC4的表达之间建立了临床联系，从而提供了潜在的诊断靶点和治疗策略。
研究结果
（1）卵巢癌（OC）中FoxO1过表达与预后不良相关。
图1：FoxO1在OC组织中上调，FoxO1的高表达与预后不良有关。
（A）FoxO1基因在GSE18520的OC和正常卵巢组织中的表达水平。
（B）IHC检测到34例OC组织和邻近正常对照组织中FoxO1表达的代表性图像。
（C-D） FoxO1染色强度（C）和定量分析（D）的代表性图像。
（E）使用Kaplan–Meier数据库分析了TCGA和GEO数据集中OC患者的OS和PFS。
表1：OC患者FOXO1蛋白水平与临床病理特征的关系。
（2）FoxO1在体外促进OC细胞增殖、迁移和侵袭
图2：FoxO1过表达促进体外OC细胞的增殖、迁移和侵袭并抑制其凋亡。
（A-B） 用FoxO1过表达质粒或空载体转染的OC细胞系中FoxO1 mRNA和蛋白质表达的比较。
（C） 使用CCK-8法分析细胞活力。
（D） 通过菌落形成实验确定的菌落的代表性图像。
（E–H） 通过流式细胞术检测EdU（E）、细胞周期（F）和凋亡（H）检测到的细胞增殖；（G）western blot检测G1/S期标记蛋白。
（I） 划痕愈合实验检测细胞迁移。比例尺=400μm。
（J-K） 通过transwell检测细胞迁移（J）和侵袭（K）能力。比例尺=200μm。
图3：FoxO1沉默在体外抑制OC细胞的增殖、迁移和侵袭并促进其凋亡。
（A-B） 用siFoxO1或siNC转染的OC细胞系中FoxO1
mRNA和蛋白质表达的比较。
（C） 使用CCK-8测定法分析细胞活力。
（D） 通过菌落形成实验确定的菌落的代表性图像。
（E–H） 通过流式细胞术测定EdU（E）、细胞周期（F）和凋亡（H）检测到的细胞增殖；（G）western blot检测G1/S期标记蛋白。
（I） 划痕愈合实验检测细胞迁移。比例尺=400μm。
（J-K） 通过transwell检测细胞迁移（J）和侵袭（K）能力。比例尺=200μm。
（3）敲低FoxO1抑制体内OC肿瘤发生
图4：FoxO1的敲低抑制了C57BL/6小鼠中ID8衍生的原位异种移植物的生长。将稳定转染shNC或靶向FoxO1的shRNA的ID8细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的背侧（n=6）。
（A-B） 通过RT-qPCR和western blot验证慢病毒产生稳定FoxO1敲低细胞系。
（C-E） （C）肿瘤结节、（D）肿瘤重量和（E）小鼠异种移植物肿瘤体积的生长曲线。
（F） 小动物的活体成像检测异种移植肿瘤的荧光强度。
（G） IHC检测shNC和shFoxO1肿瘤组织中Ki-67的表达。
4、SMC4受FoxO1转录调控
图5：FoxO1直接激活OC中的SMC4转录。
（A） OC中FoxO1下游靶标的筛选策略图。
（B） 使用GEPIA2数据库分析了OC和正常卵巢组织样品之间DEG的火山图。
（C） DEG的GO富集分析（列出了前20位）。
（D） ChIP-seq分析ID8细胞中FoxO1结合序列在DNA长度上的分布。
（E） FoxO1结合启动子区域中基因的维恩图以及细胞迁移、增殖和周期的DEG。
（F） RT-qPCR检测FoxO1的36个潜在结合靶标的表达，并稳定敲低FoxO1及其对照细胞。
（G-H） 在FoxO1的高表达或敲低后检测到SMC4的mRNA和蛋白质水平。
（I） FoxO1与SMC4启动子序列结合的IGV图。
（J） JASPAR数据库预测了SMC4启动子区域中潜在的FoxO1结合位点和motif。
（K） ChIP-qPCR验证SMC4启动子处FoxO1的富集水平。
（L） SMC4启动子荧光素酶报告基因示意图。
（M） 转染FoxO1过表达或对照质粒后，检测到SMC4-WT、SMC4-MUT或SMC4-TRU结合位点的荧光素酶活性。
（N） 转染FoxO1过表达或稳定敲低FoxO1及其对照ID8细胞的对照质粒后，检测到具有WT结合位点的荧光素酶活性。
（5）SMC4介导FoxO1加重体内OC恶性表型
图6：SMC4促进ID8细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制其凋亡，是FoxO1促进卵巢癌（OC）过程中的关键分子。
(A-B) 在GEO数据集中比较OC组织与正常上皮组织中SMC4的表达水平。
(C-D) 使用Kaplan–Meier数据库分析TCGA和GSE9891数据集中OC患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）。
(E-F) 检测转染SMC4高表达质粒或siSMC4后的SMC4 mRNA和蛋白水平。
(G) 使用CCK-8实验分析细胞活力。
(H) 通过集落形成实验确定的代表性图像。
(I–L) 通过流式细胞仪检测EdU标记的细胞增殖（I）、细胞周期（J）和凋亡（L）；
(K) 通过western
blot检测G1/S期标记蛋白。
(M) 使用划痕愈合实验检测细胞迁移。比例尺= 400μm。
(N) 通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。比例尺= 200μm。
(O) 通过western blot检测TGF-β/Smad和JAK2/STAT3通路分子的蛋白表达变化。将稳定转染了shNC或针对FoxO1的shRNA的ID8细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的背部侧翼（n = 6），并在肿瘤内注射高表达SMC4的慢病毒或对照病毒。
(P) 在肿瘤中检测SMC4的蛋白表达水平。
(Q-S) 小鼠异种移植物的肿瘤结节(Q)、肿瘤重量(R)以及肿瘤体积(S)生长曲线。
(6) FoxO1通过METTL14介导的m6A修饰促进SMC4 mRNA的稳定性
图 7：FoxO1通过调调控METTL14介导的m6A修饰来促进SMC4表达。
(A) 在用放线菌素D（5微克/毫升）处理0、3或6小时后，使用RT-qPCR分析FoxO1低表达对ID8细胞中SMC4 mRNA半衰期的影响。
(B) 在FoxO1高表达后，检测m6A修饰关键调控基因的mRNA水平。
(C) 在FoxO1高表达后，检测m6A修饰关键调控基因的蛋白水平。
(D) 使用Kaplan–Meier数据库分析GSE30161数据集中OC患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）。
(E-F) 在转染高表达METTL14质粒或siMETTL14后，检测METTL14和SMC4的mRNA和蛋白水平变化。
(G) 使用Western blot检测在敲低FoxO1后高表达METTL14对METTL14和SMC4蛋白水平的影响。
(H) 使用METTL14-RIP-qPCR检测FoxO1敲低后SMC4 mRNA的富集情况。
(I) SRAMP数据库中SMC4 mRNA的预测结果显示m6A修饰的潜在位点。红色箭头指向高置信度位点。
(J) 使用MeRIP-qPCR检测在METTL14低表达后SMC4 mRNA预测结合位点的富集情况。
(K) 使用RT-qPCR分析METTL14高或低表达对SMC4 mRNA半衰期的影响。
(L) 在ID8细胞中转染含有RNA甲基化编辑器和gRNA或非靶向gRNA（NT-gRNA）的慢病毒后，通过RT-qPCR检测SMC4 mRNA的半衰期。
(M) 在ID8细胞中转染含有RNA甲基化编辑器和gRNA或NT-gRNA的慢病毒后，检测SMC4 mRNA和蛋白的表达。
(N) 在ID8中敲低FoxO1后，使用MeRIP-qPCR检测SMC4 mRNA预测结合位点的富集情况。
(O) 使用ChIP-qPCR鉴定FoxO1在METTL14启动子的富集水平。
(P) 在转染FoxO1过表达或对照质粒后，检测METTL14-WT、METTL14-MUT结合位点的荧光素酶活性。
（7）OC中FoxO1、SMC4和METTL14的表达呈正相关
图8：在临床样本和小鼠模型中，FoxO1、SMC4和METTL14在卵巢癌（OC）中的相关性分析。
(A) 散点图显示了来自TCGA的376名OC患者OC组织中FoxO1、SMC4和METTL14
mRNA的相关性。
(B) 使用斯皮尔曼相关性分析检测了12只小鼠异种移植物中FoxO1、SMC4和METTL14
mRNA水平之间的相关性。
(C) 工作模型展示了通过转录激活和增加METTL14介导的m6A修饰来调控SMC4，从而促进OC的发展。
研究小结：
本研究揭示了FoxO1在卵巢癌（OC）中的致癌作用，以及FoxO1在SMC4的转录激活和METTL4介导的m6A修饰机制。FoxO1可以直接与SMC4启动子结合，以促进SMC4的翻译，此外，FoxO1还可以直接与METTL14启动子结合，并通过m6A METTL14依赖性方式促进SMC4的稳定性，从而促进OC细胞的增殖、迁移和侵袭（图8C）。这些发现表明，FoxO1/METTL14/SMC4轴是诊断和治疗OC的一个有前景的因素。
参考文献：
TanL, Wang S, Huang S, Tie Y, Sai N, Mao Y, Zhao S, Hou Y, Dou H. FoxO1 promotesovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6 Amodification of SMC4. Cancer Sci. 2024 Feb 25. doi: 10.1111/cas.16120. PubMedPMID: 38403332.
