今天将会用到第二天建立的rnaseq环境及对应文件路径和Day3下载好的.sra数据
今天主要学习内容是配置相关软件环境，开始数据转换，质量控制，了解参考基因组及注释文件
数据转换：其实这一步就是将下载好的.sra文件转换成fq文件，因为研究者需要将下机的fq文件压缩成sra上传到ncbi，我们这一步的工作就是再将其还原。主要用到的工具是fastq-dump，它和Day3天的perfetch同样数据sratools工具包，所以直接调用就可以。
数据质控：这一步的目的就是通过查看有无接头和低质量碱基等，得知原始数据质量咋样，不好就要进行处理，处理之后再不好那可能就是要重新检测，主要用到的软件是fastqc和multiqc，其中当我们分析数据存在多个样本时，为了方便同时查看质量信息我们将使用multiqc进行多样本合并呈现结果。
数据过滤：通过数据质控知道了数据所存在的问题，那么接下来我们要开始对原始数据进行过滤，因为接头盒低质量的碱基都会影响后续的比对、定量准确性，及下游分析。主要用到的工具为trim_galore或者trimmomatic，SOAPfilter（这三个区别）
比对：比对的软件有很多，主要有三种类型：基于基因组比对：star，hisat2；基于转录组比对：bowtie，bwa；不基于比对：salmon
定量：推荐使用featureCounts，它是subread软件下的一个小软件
开始！
第一步-软件环境
依然是使用conda进行配置，主要软件包括：数据转换，质量控制，数据过滤，比对和定量
#激活之前设置好的rnaseq环境
conda activate rnaseq 或 source activate rnaseq
#安装所需软件; -y:默认安装过程全部yes，当conda把所有软件都安装好之后才会给反馈
conda install fastqc multiqc trim-galore trimmomatic hisat2 bowtie2 subread salmon -y
请注意软件名称大小写，很重要，错了容易报错；同时还有可能存在软件依赖性，比如这里的featurecounts找不到并报错，此处的意思是找遍了所有conda下载channel也没找到它，这是我们就网页搜索一下，根据正确答案将代码替换就ok啦
当我将fastqc multiqc trim-galore trimmomatic hisat2 bowtie2 subread salmon这些软件都安装好后，每一个软件我都检测一下到底安装好没，通过：输入软件名直接回车、软件名 --help、软件名 -h、软件名 -help，以上方法均为查看该软件帮助文件，当帮助文件显示后则表示为安装成功。
但！请看（学习不认真就要入深坑）
这两个软件没有显示帮助文件，可能是安装出了问题，那么我通过网页搜索其安装方法，进行重新安装，如下，但还是出现问题：
问题一：
我以为的真的不是我以为的，我以为所有的软件的帮助文件都是这样看的，结果我错了，首先subread不是单独的软件，它还包括subread-align，subjunc，其官网：(http://subread.sourceforge.net/)，下这个软件的目的是为了使用其下面的featureCounts，所以我们直接输入 featureCounts回车，也可以证明我们这个软件安装成功
问题二：
trim-galore也不显示帮助文件，也重新安装了，没报错，去安装的路径（home/miniconda3/envs/rnaseq/bin）下看它也在里面呀，那这又咋了啊！真让人头大！
我的天！这是我们可以vi ~/.bashrc，将其添加到变量中export PATH=~/miniconda3/envs/rnaseq/bin:$PATH，source ~/.bashrc激活一下，只是再trim_galore回车就会显示帮助文件信息了
所以基于以上，当我们遇到安装软件之后不显示帮助文件信息时处理方式有三种（目前我遇到的，谁知道以后还会遇见啥呢）
1.搜索conda 软件名：根据网站提示重新安装
2.通过1没有报错，安装成功，但还是不显示帮助文件，那我们就要了解这个软件是不是唯一的，其内部会不会还有其他软件（类似问题一）
3.查看软件安装路径内是否有该软件，有的话直接添加变量就OK了（类似问题二）
Ok！配置相关软件环境完成
第二步-数据转换
由于目前测序都是双末端测序，因此将sra转换成fq后会出现两个fq文件，read1和read2，将下列脚本写入名字为sra2fq.sh中（vi sra2fq.sh）
cat srr.ids | while read I ;do
echo $i
#time fastq-dump –gzip –split-3 -A $i 路径/${i}.sra -O 输出路径 &；
done
首先在做循环脚本时，真正要运行的命令先用#注释掉（小泽提的好建议），用echo $i可以先看看这个循环是否是可行的，运行一下，看结果：
确认是我们要分析的数据列表，好了，这时回到脚本将注释打开
当我们在使用某一个软件时，帮助软件时非常有用的，因为很多参数我们没有必要都要记住，可能也记不住，所以我们要充分利用好帮助信息，查看某个软件的帮助信息的命令前面已经说了太多了（-help）
如何可以让一个安装好的软件被我们所用，也就是将它运行起来，这里用featureCounts举例（因为我终于弄明白了subread的帮助文件怎么显示了）；主要三因素，主程序+选项+参数：featureCounts [option] -a <annotation_file>，[]里内容表示可选，<>里内容为必选选项，不可忽略，在写命令时是不需要写上[]和<>。
此外，在帮助文件中你会看到有一个连字符+大/小写字母，和两个连字符+单词，两个连字符+单词要比一个连字符+大/小写字母说的更详细。这两种方式主要是对选项的调用，后面才是选项的详细描述内容。
数据转换命令详述：
time fastq-dump –gzip –split-3 -A $i 路径/${i}.sra -O 输出路径 1>sra2fq.log 2>&1 &
#time:表示计时，就是转换这个过程用了多久，可有可无
#fastq-dump:主程序
#--gzip：表示将解压出来的fq还是压缩成gzip格式，目的是节省空间内存
#--split-3：https://www.biostars.org/p/156909/，虽然其中有个3，但其实结果一般也就出2个文件
#-A指定输出结果名
#i：SRRxxxx
#-O：指出输出文件路径
#1>sra2fq.log：将结果的正确日志文件输出到sra2fq.log
#2>&1:2表示将错误信息，并将其追加到1的正确日志中。也可以将2错误信息丢弃到linux黑洞中去：2>/dev/null
#&：实现并行运算的意思，说白了就是同时跑这个循环，对i进行同时数据转换
--split-3说白了就是输出3个结果文件如下，但是我们往下分析的时候只用read1和read2，所以如果只想要2个结果文件，可以用--split-files；
好了，现在可以投任务了 nohup sh sra2fq.sh &，投任务这个时间可以准备下载参考基因组和注释文件了
第三步-参考文件
为什么需要参考文件？都有哪些参考文件？
第一个参考文件：参考基因组
转录组最终的结果就是要比较表达量的差异，那么一堆随机排列的碱基怎么看表达量差异呢？就需要一个“标准”，我们测到的不同数据都和这个标准去做比较，比上的多，我们就认为表达量高，相反表达量少，对于比对不上的，我们认为不表达。其实这里说的“标准”也就是第一个参考文件指的就是参考基因组，人类基因组经历了从hg16、hg17、hg18、hg19、hg38版本，最新版本即为hg38。
人类参考基因组：gz压缩文件800多M，解压后3G。
有3种主流的数据库可供使用下载不同物种基因组数据：NCBI、UCSC、Ensembl；
-NCBI：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/
-UCSC：http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html
-Ensembl：ftp://ftp.ensembl.org/pub/
第二个参考文件：基因组注释文件
有了基因组，可以让我们去探索得到的数据reads中哪些序列匹配到基因组上的对应位置，但是我们还是不知道对应的是什么，如果我们把基因组比作“寻路”的过程，那么注释文件就是给找好的路指定“路牌”，主要使用两个数据库：Gencode：Ensembl，下载得到的文件主要是GTF和GFF：
Gencode：https://www.gencodegenes.org/，包括人和小鼠的
Ensembl：ftp://ftp.ensembl.org/pub/current_gtf
关于GTF和GFF文件的信息请学习：小泽分享的GTF与GFF的小趣事
那么现在开始下载两个参考文件吧！
请将两个参考文件下载到之前创建的ref文件目录下（cd ref）
#genome（从ensembl下载）
wget -c ftp://ftp.ensembl.org/pub/current_fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
#annotation（从ensembl下载）
wget -c ftp://ftp.ensembl.org/pub/current_gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.96.gtf.gz
# -c的含义是断点续传
# 如果下载速度慢，可以放后台
#解压
gzip -d Homo_sapiens.GRCh38.96.gtf.gz
gzip -d Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
第四步-利用fastqc进行质控
通过fastq-dump将.sra文件转换成fq后，共生成8对SRRxxxxxx_1.fastq.gz和SRRxxxxxx_2.fastq.gz，接下来对其进行fastqc质控，在qc文件目录下进行（cd qc）
fastqc 路径/raw/*.gz -o ./ -t 10
# -t --threads 选择程序运行的线程数，越多越快哦；-o输出路径；*.gz表示该目录下所有的.gz文件；
因为我的fastq-dump命令还没有跑完，所以我单独跑已完成的.fastq.gz（此处我跑两个SRRxxxxx数据文件，方便后面multiqc使用及结果演示），如下：
运行结果会按照每个fq文件以html格式输出，然后利用filezilla导出结果（我用的导出结果是WinSCP）如下：
右键.html即可查看结果，如下：
至于这个Report怎么解读，请学习继续小泽的优秀文章====不要"太重视“fastqc的结果
FastQC Report详解：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/
因为我们最终会输出16个.html，一个一个看实在是太麻烦，所以我们利用multiqc可以将结果合并呈现
额外说明一下multiqc安装有两种方法：官网：https://multiqc.info/docs/
# pip安装
pip install git+https://github.com/ewels/MultiQC.git #Installation with pip
# conda安装
conda install -c bioconda multiqc # Installing with conda
插播：在等待安装multiqc时，所有数据fastqc结束，如下；
运行MultiQC
直接指定MultiQC要分析的文件路径即可，若数据在当前目录下输入multiqc .即可。
multiqc .
#使用--ignore忽略掉某些文件
#multiqc . --ignore *_R2*
multiqc结果解析，请学习：https://www.jianshu.com/p/f83626fd1fa1
坑！坑！关于multiqc
我以为的又不是我以为的，2个小时出坑
一定要清楚multiqc是干啥的，我一直以为是和fastqc一样的进行质控，错！我以为错了，其实它是将fastqc质检后生成的.zip文件进行质量信息结果合并呈现，所以我们应该在qc这个路径下对.zip文件进行multiqc .
顿悟这个问题的心里路程：
当我第一次运行multiqc .最先出现这个报错，下面继续出错显示WARNING
顿时蒙圈了，别人也没这个情况呀，我就开始搜索，搜呀搜呀搜呀搜，第一个警告解决，帮助来自https://github.com/yaml/pyyaml/wiki/PyYAML-yaml.load(input)-Deprecation#footnotes
找到config.py文件，对其进行编辑，vi 路径/config.py
在vi编辑器中查找yaml.load，一般都是yaml.load（f），这是我们要在其后面加上Loader=yaml.FullLoader，把所有的yaml.load中都加上，之后保存wq，退出vi
yaml.load (f, Loader=yaml.FullLoader)
接下来我们开始解决WARNING，用了1个小时解决的，我都想爆粗口，现在想想就一句话，multiqc处理的是fastqc质控后生成的.zip，找对路径找对文件执行就完事了，要被自己蠢哭了，最后生成multiqc_data和.html，使用WinSCP打开.html
