学习目标：
- 学会用MACS2 call peaks
- 理解MACS2 call peaks的结果
Peak Calling
Peak calling即利用计算的方法找出ChIP-seq或ATAC-seq中reads富集的基因组区域。
如下图所示，比对结果的文件中reads在正负链不均匀分布，但在结合位点聚集。正负链5‘末端的reads各形成一组合，通过统计学的方法评估这些组合的分布并和对照组比较，确定这些结合位点是否是显著的。
NOTE：ChIP-seq的分析方法可以鉴定两种类型的富集模式：broad domains和narrow peaks。broad domains，如组蛋白修饰在整个基因body区域的分布；narrow peak，如转录因子的结合。narrow peak相对于broad 或者分散的marks更易被检测到。也有一些混合的结合图谱，如PolII包括narrow和broad信号。
MACS2
peaks calling 有不同的方法，MACS2是最常用的call peaks工具。 MACS全称Model-based Analysis of ChIP-Seq，最初的设计是用来鉴定转录因子的结合位点，但是它也可以用于其他类型的富集方式测序。
MACS通过整合序列标签位置信息和方向信息提高结合位点的空间分辨率。MACS的工作流如下所示：
MACS2的使用方法
MACS2的用法，call peaks的参数及输出文件的解读可以参考MACS2文档学习。
了解相关参数：
输入文件参数：
-
-t:实验组，IP的数据文件 -
c: 对照组 -
f：指定输入文件的格式，默认是自动检测输入数据是什么格式，支持bam,sam,bed等 -
g:有效基因组大小，由于基因组序列的重复性，基因组实际可以mapping的大小小于原始的基因组。这个参数要根据实际物种计算基因组的有效大小。软件里也给出了几个默认的-g 值：hs -- 2.7e9表示人类的基因组有效大小(UCSC human hg18 assembly).- hs: 2.7e9
- mm: 1.87e9
- ce: 9e7
- dm: 1.2e8
输出文件参数：
-
--outdir:输出结果的存储路径
--n:输出文件名的前缀 -
-B/--bdg:输出bedgraph格式的文件，输出文件以NAME+'_treat_pileup.bdg' for treatment data, NAME+'_control_lambda.bdg' for local lambda values from control显示。
peak calling 参数
-
-q/--qvalue和-p/--pvalue
q value默认值是0.05，与pvalue不能同时使用。 -
--broad
peak有narrow peak和broad peak, 设置时可以call broad peak 的结果文件。 -
--broad-cutoff
和pvalue、以及qvalue相似 -
--nolambda: 不要考虑在峰值候选区域的局部偏差/λ
q值与峰宽有一定的联系。理想情况下，如果放宽阈值，您将简单地获得更多的峰值，但是使用MACS2放松阈值也会导致更宽的峰值。
Shift 模型参数：
-
--nomodel
这个参数和extsize、shift是配套使用的，有这个参数才可以设置extsize和shift。 -
--extsize
当设置了nomodel时，MACS会用--extsize这个参数从5'->3'方向扩展reads修复fragments。比如说你的转录因子结合范围200bp，就设置这个参数是200。 -
--shift
当设置了--nomodel，MACS用这个参数从5' 端移动剪切，然后用--extsize延伸，如果--shift是负值表示从3'端方向移动。建议ChIP-seq数据集这个值保持默认值为0，对于检测富集剪切位点如DNAsel数据集设置为EXTSIZE的一半。
示例：
- 想找富集剪切位点，如DNAse-seq，所有5'端的序列reads应该从两个方向延伸，如果想设置移动的窗口是200bp，参数设置如下：
--nomodel --shift -100 --extsize 200 - 对nucleosome-seq数据，用核小体大小的一半进行extsize,所以参数设置如下：
--nomodel --shift 37 --extsize 73
-
--call-summits
MACS利用此参数重新分析信号谱，解析每个peak中包含的subpeak。对相似的结合图谱，推荐使用此参数，当使用此参数时，输出的subpeak会有相同的peak边界，不同的绩点和peak summit poisitions.
ATAC-Seq call peaks示例
ATAC-seq关心的是在哪切断，断点才是peak的中心，所以使用shift模型，--shift -75或-100
对人细胞系ATAC-seq 数据call peak的参数设置如下：
macs2 callpeak -t H1hesc.final.bam -n sample --shift -100 --extsize 200 --nomodel -B --SPMR -g hs --outdir Macs2_out 2> sample.macs2.log
MACS2输出文件解读
-
NAME_peaks.xls
包含peak信息的tab分割的文件，前几行会显示callpeak时的命令。输出信息包含：- 染色体号
- peak起始位点
- peak结束位点
- peak区域长度
- peak的峰值位点（summit position）
- peak 峰值的高度（pileup height at peak summit, -log10(pvalue) for the peak summit）
- peak的富集倍数（相对于random Poisson distribution with local lambda）
Coordinates in XLS is 1-based which is different with BED format
XLS里的坐标和bed格式的坐标还不一样，起始坐标需要减1才与narrowPeak的起始坐标一样。
-
NAME_peaks.narrowPeak
*narrowPeak文件是BED6+4格式，可以上传到UCSC浏览。输出文件每列信息分别包含：- 1；染色体号
- 2：peak起始位点
- 3：结束位点
- 4：peak name
- 5：int(-10*log10qvalue)
- 6 ：正负链
- 7：fold change
- 8：-log10pvalue
- 9：-log10qvalue
-
10：relative summit position to peak start（？）
-
NAME_summits.bed
BED格式的文件，包含peak的summits位置，第5列是-log10pvalue。如果想找motif，推荐使用此文件。
Remove the beginning track line if you want to analyze it by other tools.???
-
.bdg
bedGraph格式，可以导入UCSC或者转换为bigwig格式。两种bfg文件：treat_pileup, and control_lambda. -
NAME_peaks.broadPeak
BED6+3格式与narrowPeak类似，只是没有第10列。
summits.bed，narrowPeak，bdg, xls四种类型输出文件的比较：
- xls文件
文件包含信息还是比较多的，和narrowPeak唯一不同的是peak的起始位置需要减1才是bed格式的文件，另外还包含fold_enrichment 和narrowPeak的fold change 对应，-log10pvalue,-log10qvalue,peak长度，peak 峰值位置等。 - narrowPeak文件
和xls文件信息类似 - summits.bed文件
包含峰的位置信息和-log10pvalue - bdg文件
bdg文件适合导入UCSC或IGV进行谱图可视化，或者转换为bigwig格式再进行可视化。
为什么染色体号后面会出现其他的字符串？？？？
