PCR或者分子克隆技术（即基于E.coli等进行的重组质粒构建）可以实现dsDNA的大量扩增，而基于切口酶的序列特异性识别与单链DNA切割活性可以实现目标ssDNA的分离。如图1，在dsDNA（PCR产物或者质粒）的同一条ssDNA上使用切口酶产生两个切口，将DNA变性后进行电泳即可分离到ssDNA。目前切口酶包括类似于限制性内切酶的固定序列识别的Nb.BbvCI（图2） ，特识别特定的序列：CCTCAGC，并在互补链上产生一个切口。这类切口酶的一个缺点是固定的识别序列限制了其广泛使用，如果在目标ssDNA中存在识别位点，就只能选择其他的切口酶。而基于Cas9 Nickase与sgRNA的特异序列识别于切割或许是一个更好的选择。（PS.与基因编辑中使用Cas9 Nickase不同，在进行ssDNA合成是，需要保证Cas9 Nickase产生的切口在同一条DNA链上。）

图1

图2 Nb.BbvCI切口酶识别切割位点