摘要
根系相关微生物在植物对环境胁迫的响应中发挥着重要作用。然而，控制盐胁迫植物与微生物之间相互作用的潜在机制却知之甚少。该研究通过聚焦耐盐植物野大豆(野生大豆)，证明了以假单胞菌属( Pseudomonas )为主的高度保守的微生物在盐胁迫植物的根系和根际微生物群中富集。两个相应的假单胞菌分离物被证实可以增强野生大豆的耐盐性。Shotgun宏基因组和宏转录组测序发现，运动相关基因，主要是趋化性和鞭毛组装，在盐处理样品中显著富集和表达。盐胁迫植物根系分泌嘌呤类物质，尤其是黄嘌呤，诱导假单胞菌的运动性。此外，外源施加黄嘌呤到非胁迫植物导致假单胞菌富集，再现了盐胁迫根中的微生物群落变化。最后，假单胞菌突变体分析表明，运动相关基因cheW对于趋化黄嘌呤和增强植物耐盐性是必需的。研究表明，野生大豆通过分泌关键代谢产物(嘌呤)来招募有益的假单胞菌来抵御盐胁迫。
实验设计
农业土壤 (pH 8.42, EC 337 μs/cm,TC (%) 4.63,TN (%) 0.76, organic matter（有机质） 21.6mg/kg) 中种植野生大豆。种子用0.15%的氯化汞和无菌水灭菌后无菌发芽，之后采用盆栽实验，生长10天后用三种盐浓度（100,200,300 mM NaCl）处理。胁迫1, 7, 14天后采样。洗根法采集根际土壤（具体看原文献）。测定EC和总碳、总氮含量。提取土壤DNA、RNA，送测。进行宏基因组测序和转录组测序。测定土壤代谢组和分泌物。qPCR测定细菌和假单胞菌总丰度。（实验中300mM处理下植物全部死亡，最后只保留了两个处理）
细菌分离培养试验和接种验证。假单胞菌定殖实验。对两种菌株进行全基因组测序。假单胞菌的化学突变体构建 （cheW mutants construction of Pseudomonas）。定量趋化性测定。外源性黄嘌呤试用。
结果
1、盐胁迫影响大豆生长
如图
2、盐胁迫下细菌多样性和区室间的优势分类群
多样性和群落结构如图
盐胁迫对根系群落的影响最大。在目的水平上，与对照组相比，第 7 天和第 14 天，所有盐处理根样品中假单胞菌和链霉菌的相对丰度显着增加（图 2c）。盐处理的根和根际样品中相对丰度较高（累积相对丰度> 20%）的富集属仅分布在Gammaproteobacteria 或 Actinobacteriota中（补充图3a，b）。为确定放线菌和Gammaproteobacteria 的富集是否由总细菌绝对丰度的增加引起，使用qPCR量化根际土壤和根中总细菌丰度。总体而言，野生大豆根系、根际土壤和块状土壤微生物群对整个分类图谱中的盐胁迫反应不同。
3、盐胁迫增加根系和根际中假单胞菌丰度
在变化最大的前10个属中，假单胞菌（盐处理富集）在根内和根际中均表现出最高的丰度（累积相对丰度＞22.17%）（图3a，b）。假单胞菌在3种盐处理根系中均富集，其相对丰度从对照组的2.19%增加到100、200和300 mM NaCl处理的25.00%、16.58%和37.42%（图3a）。根际中假单胞菌在盐处理中的富集度也很高，比对照组高出16倍（图3b，d）。假单胞菌不仅是最丰富的成员（图3e），而且在盐处理样品中转录相对丰度达到了21.94%，在对照中仅为11.49%（图3f）。为了评估假单胞菌富集的特征在其他土壤和植物中的可重复性，利用驯化大豆（G. max）和另一种山东土壤验证其统一性。结果表明，在所有情况下，盐胁迫下假单胞菌的相对丰度均高于对照（补充图6），表明盐诱导的假单胞菌富集在不同微生物组背景下是保守的。然而，需要对更多的土壤类型和植物进行研究，以验证盐诱导的假单胞菌富集是否广泛存在。
进一步研究假单胞菌属中个体OTU的组成，共发现24个OTU属于假单胞菌属，其中OTU4227是根际土壤中含量最高的分类单元，但其在根中优势较小，OTU2336是显著丰富的分类单元，在盐处理中丰度较高。盐胁迫使得根和根际土壤富集了OTU4227，而OTU2336则表现出生态位偏好。总的来说，这些结果表明盐诱导的假单胞菌富集发生在根和/或根际中。
4、两种假单胞菌分离株在盐胁迫下拯救了野生大豆生长
分离出了34株假单胞菌，鉴定出了Pseudomonas frederiksbergensis YE17和P. stutzeri XN05-1两种。使用两种菌株 P. stutzeri XN05-1 和 P. frederiksbergensis YE17 作为富含盐分的假单胞菌的代表，在使用无菌土壤的对照接种实验中测试它们对野生大豆生长的影响。详细信息在附图附表中。
野生大豆种子在无菌土壤中生长14天，然后进行10天的盐胁迫。菌株XN05-1和YE17在盐胁迫前接种到土壤中。测量野生大豆的根部和芽部生长参数。非盐胁迫条件下，只有菌株YE17增加了根系生长，而没有增加芽的生长（图4）。在盐胁迫下，假单胞菌分离株XN05-1和YE17显著改善了野生大豆的根和芽生长（包括长度和鲜重）（图4）。这表明这些菌株诱导的植物生长增强主要是针对盐胁迫条件的。盐胁迫验证假单胞菌定殖发现，盐胁迫下假单胞菌丰度更高。
5、盐处理增加根际细胞运动基因和转录表达
根据COG数据库注释的宏基因组数据，对照组和三种盐处理组之间的显著差异。由于用300mM NaCl处理的样品与其他两种盐处理相比，与对照组的差异更大，因此该组用于进一步精细分析。COG分析显示，细胞运动（COG类别：N）、转录（COG类别：K）以及几个生物发生、运输和代谢相关过程在盐处理根际土壤中显著富集。与细胞运动相关的基因倍数在所有COG中最高。
为更深入了解盐胁迫下功能表达，进行了独立盐胁迫实验，从对照和盐处理植物的根际土壤中提取了高质量的总RNA。189,319个基因中有96803个基因是差异表达基因（DEGs）。COG功能分析显示，与细胞运动（COG类别：N）和翻译、核糖体结构和生物发生（COG类别：J）相关的DEGs在盐处理中分别富集了2.5倍和2.0倍（图5b）。由于细胞运动基因在盐处理样品的微生物群体中被高度转录，因此对这一类别进行了更精细的分辨率分析。细菌趋化性和鞭毛组装是细胞运动的两个亚类，两者在盐处理组中都显着富集（补充图10）。 395 个 DEG 被分配到细菌趋化性（329 个上调基因和 66 个下调基因），729 个 DEG 被分配到鞭毛组装（654 个上调基因和 75 个下调基因）（补充表 3）。在上调的细菌趋化性 DEG 中，表达甲基接受趋化性蛋白（MCP;倍数变化 = 6.14）和嘌呤结合趋化性蛋白CheW（倍数变化 = 4.70）的基因在数据集中表达最高（图 5c）。主要的鞭毛组装DEG是编码鞭毛蛋白FliC的基因，该基因在鞭毛介导的趋化运动中起作用，与对照组相比，在盐处理的根际土壤中富集了3.66倍（图5d）。这些结果表明，盐胁迫改变了根际细菌群落，使其以表达细胞运动基因的细菌为主。
对相关 DEG 进行了分配分析表明，盐诱导的细胞运动增加主要归因于假单胞菌（图5e，f）。通过对两种假单胞菌分离株XN05-1和YE17的基因组进行测序（补充图11），发现它们具有一系列运动相关基因，包括鞭毛组装所需的鞭毛（fli、flgand flh）和运动（mot）基因（补充数据2）。此外，菌株XN05-1和YE17基因组均含有细菌趋化系统的两个主要基因簇，并且它们包括编码CheW的三个基因，即cheW1、cheW2和cheW3（补充数据2和补充图12）。总的来说，上述数据表明盐胁迫改变了根际微生物组的转录活性，特别是细胞运动性，而根际功能的变化可能是由假单胞菌属物种驱动的。
5、根部分泌物成分黄嘌呤促进假单胞菌富集
收集盐胁迫野生大豆根系渗出物中诱导假单胞菌富集的潜在关键代谢物，并进行非靶向代谢组测序。总共鉴定出658种代谢物，其中大部分是脂质、类黄酮、有机酸和酚酸（补充图13）。在与假单胞菌呈正相关关系的代谢物中，N-环己基甲酰胺、黄嘌呤和2,4,5-三甲氧基苯甲酸的丰度分别比对照组高6.64倍、6.07倍和5.30 log10倍，是前3位富集代谢物（补充图14和补充表4）。这些化合物在对照中几乎未检测到，但在盐处理植物中大量分泌（补充图15），这表明它们是与盐胁迫相关的特定化合物。最终发现，黄嘌呤含量与盐胁迫呈现正相关性且其对人体无害，因此重点研究黄嘌呤的作用。将假单胞菌菌株YE17和XN05-1的混合培养物接种到无菌土壤中，并种植野生大豆幼苗。结果显示，黄嘌呤补充组假单胞菌的绝对丰度高于对照组（补充图16）。为了进一步测试施用黄嘌呤后根部的假单胞菌富集是否是属特异性状，将黄嘌呤添加到生长野生大豆幼苗的天然土壤中。收集根际土壤和根系样品，进行16S rRNA扩增子测序，研究黄嘌呤富集微生物。我们发现黄嘌呤明显改变了根系和根际土壤中的细菌群落（图6b）。添加黄嘌呤的组中假单胞菌呈现倍数增加（21.5倍）。结果表明，黄嘌呤诱导的细菌富集在很大程度上是假单胞菌属特有的。外源黄嘌呤的添加再现了在盐胁迫条件下观察到的野生大豆根系内假单胞菌富集的结果，进一步支持了根系分泌的黄嘌呤在假单胞菌的招募中起着重要作用。
为了验证假单胞菌的富集是否与野生大豆中增强的盐胁迫耐受性直接相关，进行了验证实验，包括接种不含黄嘌呤的假单胞菌、施用黄嘌呤但缺乏假单胞菌和在黄嘌呤存在的情况下接种假单胞菌。结果表明，单独添加黄嘌呤对植物生长的促进作用不显著，而在假单胞菌存在下显著增强了植物生长（图6d）。总结来说，施用黄嘌呤后野生大豆生长促进依赖于假单胞菌。
7、运动相关基因对趋化性对嘌呤和植物盐耐受性的作用
盐胁迫下运动相关基因表达增加。假设运动相关基因chew在嘌呤诱导的假单胞菌富集中具有重要作用。随后评估了黄嘌呤对假单胞菌分离株趋化性的影响。结果表明，菌株XN05-1和YE17均对黄嘌呤表现出强烈的趋化性（补充图18a，b）。此外，还对两种假单胞菌分离株对其他嘌呤或其衍生物（例如6苄基氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤）进行了定量趋化性测定（补充表5）。结果表明，菌株XN05-1和YE17均对大多数这些化合物表现出趋化性（补充图18c，d）。
在两个假单胞菌中敲除chew基因验证其作用，中采用XN05-1和YE17的ΔcheW1、ΔcheW2和ΔcheW3菌株，，XN05-1ΔcheW3和YE17ΔcheW3菌株对黄嘌呤仍有明显的趋化性。然而，XN051ΔcheW1和YE17ΔcheW1完全丧失了对黄嘌呤的趋化性，而XN05-1ΔcheW2和YE17ΔcheW2的趋化性则受损（图6e，f）。用突变株接种盐胁迫下的野生大豆幼苗，发现仍具有趋化能力的ΔcheW3突变株与野生型株表现出相同的植株生物量。XN05-1 和 YE17 的 ΔcheW1 和 ΔcheW2 突变体都不能表现出植物生物量的增加（图 6g）。这凸显了运动相关基因 cheW 在宿主与根相关假单胞菌相互作用中的关键作用。综上所述，研究结果表明，在盐胁迫条件下，野生大豆渗出的特定代谢产物（如黄嘌呤）会影响根系微生物区系，从而吸引假单胞菌，进而促进植物在盐胁迫条件下的生长（图 7）。
结论
盐诱导根系相关微生物群的作用强于非根际土壤。假单胞菌是主要的胁迫反应类群，其相应的分离株可以促进野生大豆在盐胁迫下的生长，与先前报道的“呼救“理论”一致。根分泌的嘌呤或其衍生物，特别是黄嘌呤，可以增加假单胞菌的运动和定植能力，与盐处理中观察到的参与细胞运动的基因的表达高于对照。因此，我们得出结论，根系分泌物成分嘌呤将土壤假单胞菌吸引到根系中，并有利于植物在盐胁迫条件下的生长。
