在发育过程中，细胞会对刺激做出反应，在整个生命过程中，从一种功能性“状态”转变为另一种功能性“状态”。处于不同状态的细胞表达的基因不同，产生蛋白质和代谢物的动态重复序列，从而完成它们的工作。当细胞在不同状态间转变时，会经历转录重组的过程，其中一些基因被沉默，而另一些基因被激活。这些瞬时状态通常难以表征，因为在更稳定状态之间纯化细胞是困难或不可能的。单细胞RNA-Seq可以使您在不需要纯化细胞的情况下查看这些状态。然而，要做到这一点，我们必须确定每个细胞的可能状态范围。
今天给大家介绍的是基于Monocle2（目前Monocle已经更新至3版本，该版本仍处在开发阶段）的拟时分析。Monocle不是通过实验将细胞纯化成离散状态，而是使用一种算法来学习每个细胞必须经历的基因表达变化序列，作为动态生物学过程的一部分。一旦它了解了基因表达变化的整体“轨迹”，Monocle就可以将每个细胞放置在轨迹中的适当位置。Monocle依靠一种叫做反向图嵌入的机器学习技术来构建单细胞轨迹（算法参考文献：Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories）。
Monocle2分析主要基于以下3个步骤：
1、基因筛选：Monocle寻找以“有趣”(即不只是嘈杂)方式变化的基因，并利用这些基因来构造数据。
2、降低维度：一旦选择了用于细胞排序的基因，Monocle就会对数据进行降维处理。
3、pseudotime对细胞排序：通过将表达数据投影到较低维空间，构建细胞间的分化轨迹。
结果解读：
图一：树形结构轨迹图
图中每个点代表一个细胞，具有相似细胞状态的细胞被聚到一起，每个分支点代表着一个可能的细胞生物学过程决策点（该例图中有2个分支点）。左图为按照细胞聚类信息进行颜色标注（如果您已经对每个cluster进行了细胞鉴定，也可以基于具体的细胞进行着色），右图为按照分化状态（State）进行颜色标注。
当细胞cluster或state数量过多时，很难看出每个cluster或状态落在树上的哪个位置（如图一左图）。因此，我们还可以将每个cluster或状态的轨迹图分开展示，便于对每个cluster或状态进行研究。
图二：每类细胞（或State）轨迹图
确定了分化起点后，Monocle可以模拟出每个细胞所处的分化时间（pseudotime，伪时间），并寻找随着分化时间逐渐升高或降低的基因（图四为拟时序变化相关基因（Top6）表达分布图和top50基因热图，如果有特别关注的基因也可以基于关注的基因进行绘制）。
图三：每个细胞分化时间（pseudotime）轨迹图
图四：拟时序变化相关基因表达分布图和热图
