1.腺病毒载体分类

第一代腺病毒载体：指E1或E3基因缺失的腺病毒载体。

特点：

(1)外源基因容量为6.5-8Kb；

(2)适用于大多数基因治疗，且容易获得高滴度的病毒；

(3)可用于表达重组蛋白质或将外源基因导入对其他转染方法不敏感的细胞株中；

(4)若未经纯化使用，容易引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用。

第二代腺病毒载体：指E2A或E4基因缺失的腺病毒载体。

特点：

(1)外源基因容量增加，可达14Kb；

(2)病毒蛋白表达降低，引发机体的免疫反应比第一代弱；

(3)外源基因表达时间较长；

(4)病毒产量较低，且滴度降低。

第三代腺病毒载体：也称为空壳载体或辅助病毒载体，指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅可保留ITR和包装信号序列的腺病毒载体。

特点：

(1)外源基因容量大幅度提高，可达37Kb；

(2)无病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应，提高了安全性；

(3)外源基因可长期稳定表达；

(4)需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒；

(5)可反复应用，无需考虑机体的抗腺病毒中和抗体的影响。

2.腺病毒载体包装方法

传统的双质粒共转染法

将插入了外源基因的穿梭载体质粒与携带腺病毒基因组的质粒共转染293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组（同源序列的DNA分子之间或者分子之内的重新组合），形成重组腺病毒载体基因组，并包装成病毒颗粒。

局限性：

(1) 操作较复杂，因其易被亲代病毒污染，需经过多次纯化和鉴定；

(2) 重组效率低，耗费时间较长。

注：此方法适用于临床。

(1)Ad-Easy法

将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染RecA+细菌，在细菌RecA 重组酶的作用下，经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其酶切纯化后转染293细胞，包装成重组病毒颗粒。

特点：

(1) 酶切和连接步骤少，操作简便；

(2) 可选择的穿梭载体多；

(3) 同源重组率达60%以上，效率相对较高；

局限性：

(1) 某些腺病毒基因容易发生突变；

(2) 设备和技术要求较高。

AdMAX双质粒转染法

利用Cre/loxP重组酶系统在293细胞中获得重组病毒。将插入外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染293细胞，并在Cre重组酶作用下重组，获得重组病毒颗粒。

特点：

(1)操作简单；

(2)不需要反复进行空斑纯化；

(3) 目的基因表达水平高；

(4) 重组效率高，比传统双质粒共转染法提高约100倍，若插入的外源基因小于8Kb，感染率几乎达100%。

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