• shRNA序列

  
  
  shRNA序列示意图

此为negative control shRNA序列，虽然设计完靶基因的shRNA片段后，但是在后续的实验中，还需要有相应的对照，根据Sigma提供的信息以及文献中的内容，对照通常要做两个，一个是空载体，也就是没有插入shRNA片段的pLKO载体，另外一个就是含有一个没有靶向任何基因的shRNA的载体（sigma官网的货号是SHC002）,但是网上也能查到载体中的这段序列，如下所示：
CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTG。在构建shRNA慢病毒载体时，就可以使用这个shRNA片段来作为阴性对照。也称为SCR：scrambled shRNA，即不靶向任何基因。

从上面的图上我们可以看出，中间的绿色部分就是最终形成茎环的部分，左侧的红色部分序列是CCGG，与右侧的橘色部分是TTTTTG，这两个序列都是与pLKO-puro载体连接的部分，其中CCGG是AgeI酶切位点的粘性末端，TTTTTG则是保证了shRNA转录出来后，其末端是连续的4个U，即UUUU。蓝色与红色部分的黑色字母标注的部分则是与FLCN的CDS互补的序列。

*   正义链： 5‘ --- CCGG—21bp sense—<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">CTCGAG</mark>（loop）—21bpantisense—TTTTTG --- 3 具体如下图所示

image.png

以FLCN这个基因为例，第1条链基本上都可以在Sigma的官网上查到，现在我们设计第1条shRNA的反义链序列，前面提到，pLK-puro空载体上用于连接shRNA的两个酶切位点是AgeI与EcoRI，因此在设计反义链的时候，需要添加上EcoRI的酶切位点的粘性末端，如下所示：

image.png

• 反义链： 5‘ --- AATTCAAAAA—21bp sense—<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">CTCGAG</mark>(loop)—21bp antisense --- 3’
  综上所述，如果构建这个基因最后的正义链和反义链如下：

正义链：5‘ --- CCGGGATGGAGAAGCTCGCTGATTT<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">CTCGAG</mark>AAATCAGCGAGCTTCTCCATC<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">TTTTTG</mark> --- 3’

反义链：5‘ --- AATT<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">CAAAAA</mark>GATGGAGAAGCTCGCTGATTT<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">CTCGAG</mark>AAATCAGCGAGCTTCTCCATC --- 3‘

shRNA序列设计：

• 官网搜索shRNA --- 点击“MISSION® shRNA Product Offerings”
• 点击“检索” 输入基因名称点击搜索
• 物种选择“人类”，校对选择“是”
• 尽量不要选择在UTR区域的，因为会影响RNA的干扰情况，选择在CDS区域。
• 可根据有无验证进行选择，“已验证”表明已经有文章验证过，也可以在blast中进一步比对序列特异性

参考：http://www.360doc.com/content/19/0121/15/42030643_810389017.shtml