无细胞DNA（cfDNA）分析已成为微创液体活检的基石。我们总结了过去五年来的主要进展——对cfDNA基础生物学的深入理解、湿实验室和干实验室方法的创新以及临床结果数据的积累——并探讨了该领域未来五年的发展前景。
无细胞DNA (cfDNA) 指的是存在于血浆和其他体液中、未被细胞包裹的DNA片段。cfDNA目前已成为微创液体活检领域的前沿技术，可用于癌症检测、产前检测和移植排斥反应监测。回顾该领域的发展历程——自1997年在母体血浆中发现胎儿来源的cfDNA以来，已近三十年 [Lancet. 1997; 350:485-487]——我们不难理解，生物学见解、技术创新和临床验证之间的协同作用至关重要。一个值得注意的转变是，研究方向已从基因变异分析转向整合表观遗传学和片段组学读数 (readouts)，这些读数编码了有关组织来源和基因组结构的信息 [Cancer Cell. 2025; 43:1792-1814]。这些生物标志物的分析不仅得益于大规模并行测序技术的进步，也得益于能够从日益高维的数据中学习的算法的开发 [Genome Res. 2025; 35:1-19] 。严格的临床试验仍在真实临床环境中检验基于cfDNA的分析方法。未来五年，液体活检领域比以往任何时候都更有优势重新定义其局限性。
cfDNA生物学的新前沿
过去五年，我们对cfDNA生物学的理解取得了显著进展，这反过来又为该领域开辟了越来越多的令人振奋的机遇。特别是，cfDNA生成和清除的基本机制——cfDNA的来源组织、其产生和释放机制以及其从循环系统中清除的途径——仍然是该领域关注的焦点，因为它们对基于cfDNA的诊断和疾病监测具有深远的影响 [Med. 2025; 7, 100926]。
2023年，迄今为止最全面的细胞类型特异性DNA甲基化图谱被开发出来，以前所未有的分辨率解析cfDNA的组织来源 [Nature. 2023; 613:355-364]。然而，将不同细胞类型对cfDNA的贡献与其理论细胞周转率进行比较，似乎表明只有不到5%的死亡细胞DNA能够进入血液循环 [eLife. 2024; 12, RP89321]。 这对基于cfDNA的诊断具有重大意义：例如，这可以部分解释为什么身体某些部位的癌症比其他部位的癌症更容易通过基于cfDNA的检测方法进行检测，尽管它们的细胞周转率或血管可及性相当。我们期待着旨在解决这一悖论的研究，例如对局部DNA清除机制及其对cfDNA图谱影响的研究。
五年前，我们参与了关于cfDNA可能通过至少三种主要途径清除的讨论：被动滤入尿液、核酸酶直接降解以及细胞主动摄取 [Trends Genet. 2021; 37:758-770]。这些cfDNA生物学方面的临床意义正逐渐显现。例如，对经肾cfDNA的表征，特别是其优先来源于开放染色质区域的观察，为检测或监测慢性肾脏疾病和泌尿系统癌症开辟了新的途径 [Med. 2025; 6, 100646]。对cfDNA片段末端核酸酶切割特征（即“末端基序”）的分析已在多种癌症类型的诊断模型中取得成功 [Cancer Cell. 2025; 43:1792-1814]。关于细胞主动摄取，一项令人振奋的发现是血小板在cfDNA隔离中的作用 [Science. 2025; 389:eadp3971]。从生物学角度来看，这意味着网状内皮系统的巨噬细胞可能并非循环DNA的唯一细胞清除器。临床上，检测结直肠癌患者血小板中携带疾病特异性基因突变的DNA，可能对癌症液体活检的分析物选择具有重要意义。我们热切期待未来开展临床试验，评估基于血小板的液体活检在真实临床队列中的性能。
近期的研究进展或许也赋予了我们主动干预其生物学过程的能力。通过使用引发剂（priming agents, 例如阻断核酸酶活性的anti-dsDNA抗体、阻断组织驻留巨噬细胞摄取cfDNA的脂质体纳米颗粒）调节cfDNA的清除，可以显著提高血浆中cfDNA的总浓度 [Science. 2024; 383, eadf2341]。在携带细胞系来源肺转移瘤异种移植的小鼠模型中，采血前给予引发剂可使循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）分子数量增加60倍。我们期待未来开展临床试验，评估其在提高基于ctDNA的诊断灵敏度方面的实际应用价值。长期以来，由于含有肿瘤特异性特征的cfDNA片段比例极低，提高基于ctDNA的诊断灵敏度一直是一项挑战。
实验室化学和计算方法的创新
如果没有多种技术的共同作用，许多cfDNA特征的鉴定及其作为疾病生物标志物的后续开发将无法实现，这体现了科学发现与创新之间长期存在的相互依存关系。尤其值得一提的是，生物化学和计算技术的进步对于cfDNA片段化模式研究（“片段组学”）的兴起至关重要，而这又源于人们对这些模式与基因组结构和表观遗传图谱之间关系的日益浓厚的兴趣 [Cancer Cell. 2025; 43:1792-1814]。
最初为研究高度降解的古代DNA而开发的低分子量DNA提取和文库构建方案，如今已应用于“超短”cfDNA的研究。超短cfDNA是一类长度约为50个核苷酸的单链cfDNA，其生物学意义尚待充分阐明 [Genome Res. 2022; 32:215-227]。另一方面，单分子长读长测序技术在表征“长”cfDNA方面发挥了重要作用，长cfDNA的长度可达数万个碱基对 [Genome Res. 2024; 34:189-200]。单分子长读长测序平台的测序通量不断提升，令人鼓舞。最新的单分子实时测序系统声称可同时支持多达1亿个零模波导 [Genomics. 2024; 116, 110842]。基于此，我们预测，利用多个独立片段信息的高维片段组学方法，未来可能更适用于长cfDNA的研究。鉴于长 cfDNA 的新兴特性和生物学意义，高通量长读长测序技术的应用可能会带来新的生物学见解和诊断机会。
对高维cfDNA特征的分析一直依赖于人工智能（AI）和机器学习方法 [Genome Res. 2025; 35:1-19]。基于Transformer的AI的爆炸式增长为解码DNA序列的“语言”提供了一种潜在的革命性方法。我们近期回顾了一些引人深思的尝试，即应用Transformer架构（例如大型语言模型（LLM））来分析cfDNA片段组学模式，以用于癌症诊断 [Cancer Cell. 2025; 43:1792-1814]。 然而，鉴于这些模型是在自然语言上训练的，它们对基因组序列的鲁棒性仍然存在疑问。我们预计，在未来五年内，语言模型将取得令人振奋的进展，从而更有效地利用cfDNA片段组学的高维特性。
临床验证和患者结局
评估基于cfDNA的诊断、治疗监测和风险预测模型的临床试验持续取得令人鼓舞的结果 [Cancer Cell. 2025; 43:1792-1814]。过去几期的《Med》杂志曾刊登过一些关于利用ctDNA中特定基因突变检测微小残留病灶、监测治疗反应和预测疾病预后的优秀研究。例如，在一项针对六名患有不同肾脏恶性肿瘤患者的病例研究中，使用个性化高灵敏度肿瘤特异性ctDNA检测方法进行连续ctDNA监测，可以在影像学证据出现之前预测复发或转移 [Med. 2025; 6, 100806]。在cfDNA表观遗传学和片段组学时代，我们预计，在未来五年内，评估这些新兴生物标志物在无症状筛查人群中性能的大规模多中心临床试验将稳步提供长期风险预测和生存数据。近期一项针对香港约2万名无症状华裔男性的临床试验表明，对血浆中EB病毒DNA进行多模式片段组学分析可以预测未来四年罹患鼻咽癌的风险 [Cancer Cell. 2025; 43:728-739.e5]。我们热切期待其他针对多种癌症的大规模前瞻性研究的数据。
结论
cfDNA有望将微创液体活检带到前所未有的领域。总而言之，过去五年见证了cfDNA发展成为人类生物学和疾病的多维界面。未来五年将对其真正潜力进行考验，这得益于对其来源和清除机制的深入了解、实验室化学和计算方法的不断丰富，以及特征合成和解读技术的改进。最终，开展将cfDNA分析与确切临床结果联系起来的前瞻性多中心试验，将是该领域发展的关键所在。
Tsui WHA, Lo YMD (卢煜明). Cell-free DNA in 2030. Med. 2026;7(1):100963. doi:10.1016/j.medj.2025.100963
