摘 要： 在固相多肽合成中，Dmab作为羧基保护基具有脱保护条件温和、步骤简便、选择性高的特点，但有时脱保护效率并不稳定. 为此，基于Fmoc/tBu/Dmab三维正交保护策略，利用固相多肽合成技术设计并合成了4个肽树脂，对固相多肽合成中Glu和Asp主链和侧链羧基的Dmab保护基脱除规律进行了研究. 结果显示，树脂上α-ODmab的脱保护快速、完全，β-ODmab和γ-ODmab脱保护反应较慢，可以检测到相应的中间产物(4-氨基苄酯肽)，推测脱保护效率由快到慢依次为 α-ODmab > β-ODmab > γ-ODmab. 该结果表明Dmab作为α-COOH保护基具有较高的应用价值，但用于β-COOH和γ-COOH保护时，其脱保护条件尚不成熟.
关键词： Dmab保护基；脱保护；固相多肽合成
Dmab(4-{N-[1-(4,4-Dimethy-2,6-dioxocyclohexylidene)-3-methylbutyl] amino} benzyl)是近年来用于固相多肽合成的新型保护基团[1-4](图1)，用作保护氨基酸的羧基，在20%哌啶或三氟乙酸(TFA)中稳定存在[5]. Dmab的脱除分两步进行，首先，ivDde(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-3-methylbutyl)可以通过2%水合肼溶液选择性地脱去；然后，剩余的氨基苄基(4-aminobenzyl)经1,6-电子迁移自发消去，从而得到相应的羧酸[6-7](图2).
Dmab作为羧基的临时保护基，具有脱保护便捷、温和、选择性高以及与常规Fmoc/tBu策略的固相多肽合成技术相容性高等特点. 基于Fmoc/tBu/Dmab三维正交保护策略的固相合成内酰胺环肽的方法陆续有报道. CHAN等[5]使用该策略合成了一种类速激肽拮抗剂环肽，即将Fmoc-Glu-ODmab固定在树脂上，肽链构建完毕后直接在固相上进行环化反应，然后，从树脂上裂解下来得到目标环肽. 随后，其他带三功能基团氨基酸Asp[8]、Tyr[9]、Lys[10]也相继有用于该策略合成环肽的报道. 另外，该策略还可以用来合成某些复杂的多肽，如糖肽[2]或杂环肽[3].
但是一些研究在应用Fmoc/tBu/Dmab策略合成多肽时发现[5-6]，Dmab在作为Glu和Asp的羧基保护基时，脱除反应效率不稳定，有时会大大影响目标产物产率. 我们在研究中也发现了该现象. 因此，设计了含有Glu和Asp的两个肽链，采用Fmoc/tBu/Dmab策略构建线性肽树脂，研究了固相树脂上Dmab作为羧基保护基时α-ODmab、β-ODmab和γ-ODmab的保护基脱除反应的差异，探索Dmab使用的条件及规律.1 实验部分1.1 仪器与试剂主要仪器：Agilent 1100分析型HPLC，Agilent 6410 Triple Quad LC/MS(Agilent公司，美国)；R-200旋转蒸发仪(Buchi公司，瑞士).
主要试剂：2-氯代三苯甲基氯树脂(2-CTC Resin)、Fmoc保护氨基酸(Fmoc-Glu(ODmab)-OH，Fmoc-Glu-ODmab，Fmoc-Asp(ODmab)-OH，Fmoc-Asp-ODmab，Fmoc-Glu-OtBu，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-D-Phe-OH)、苯并三唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBt)，GL Biochem公司；二异丙基乙胺 (DIEA)，J&K Chemical公司；2,2,2-三氟乙醇(TFE)，Alfa Aesar公司；色谱纯乙腈(ACN)，色谱纯甲醇(MeOH)，Sigma公司；水合肼(N2H4·H2O)，TCI试剂公司；其他试剂均为国产分析纯.
1.2 方法
1.2.1 肽树脂的制备以肽树脂1(H2N-(-GluOtBu-)4-GluODmab-Resin)的合成为例.
将Fmoc-Glu-ODmab 1.36 g(2.0 mmol)溶于DCM 20 mL中，加入DIEA 350.0 μL(2.0 mmol)，配成氨基酸溶液. 称取的2-CTC Resin 2.05 g(0.933 mmol·g-1)置于固相反应器中，立即加入氨基酸溶液，振荡5 min；再次添加DIEA 525.0 μL(3.0 mmol)，室温振荡反应1.5 h. 加入MeOH 1 640.0 μL，振荡15 min，封闭剩余树脂位点. 用DCM(20 mL×3)、DMF(20 mL×2)、DCM(20 mL×2)、MeOH(20 mL×3)依次洗涤树脂，抽干并转移树脂至培养皿中干燥12 h. 称重树脂，得3.06 g，增重1.01 g；经计算，被固定在树脂上的保护氨基酸的量约为1.5 mmol.
将氨基酸树脂转至固相反应器中，DCM溶胀15 min，DMF(20 mL×3)洗涤，20% 哌啶/DMF溶液(20 mL×2)脱除Fmoc保护基2次(2 min，8 min)，DMF(20 mL×5)洗涤. 称取Fmoc-Glu-OtBu 1.92 g(4.5 mmol)、HBTU 1.62 g(4.3 mmol)、HOBt 0.61 g(4.5 mmol)，溶于25 mL DMF中，加入DIEA 1.58 mL(9.0 mmol)，活化5 min. 将活化好的氨基酸溶液加入固相反应器内，反应1.5 h，DMF(20 mL×5)洗涤. 取少量树脂用Kaiser Test检测为阴性后，进行下一个氨基酸的连接. 上述方法依次连接氨基酸Fmoc-Glu-OtBu×3，偶合反应后均进行Kaiser Test定性检测树脂上的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶联循环；若结果为阳性，则重新投入活化好的氨基酸溶液，再次进行该循环反应. 最后，使用20% 哌啶/DMF溶液(20 mL×2)脱除Fmoc保护基，即可得到载有Dmab保护基的肽树脂1.
用相同的方法合成肽树脂2(H2N-(-GluOtBu-)4-Glu(ODmab)-Resin)、肽树脂3(H2N-D-Phe-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-AspODmab-Resin)、肽树脂4(H2N-D-Phe-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(ODmab)-Resin).
1.2.2 Dmab的脱除
称取0.10 g肽树脂1,2,3,4分别置于固相反应器内，用2% N2H4·H2O/DMF(2 mL×2)溶液脱除Dmab保护基2次(10 min×2)；DMF(2 mL×3)、DCM(2 mL×2)、MeOH(2 mL)、DCM(2 mL×3)依次洗涤树脂，抽干.
1.2.3 肽树脂的裂解
将上述肽树脂转移至圆底烧瓶内，置于冰水浴中，加入裂解液(按体积比配置：DCM+TFE+HOAc(8+1+1))1 mL，电磁搅拌，反应30 min；过滤，滤液在旋蒸仪上减压除去溶剂，残留的醋酸通过反复加入正己烷后减压除去，得到粗肽样品.1.2.4 产物的分析使用0.1% TFA/ACN溶解样品，进行RP-HPLC分析(使用Agilent 1100 HPLC，色谱条件为：Vydac 218TP54 C18(4.6×150 mm)分析柱；流动相A为0.1% TFA/H2O溶液，流动相B为0.1% TFA/ACN溶液；洗脱梯度为0～30 min，10%～70% B；进样体积为3 μL，流速为1 mL/min，检测波长为214 nm)；收集主要馏分，进行ESI-QQQ-MS分析(使用Agilent 6410 Triple Quad MS，质谱条件为：毛细管电喷雾电压为4 kV，采用正离子检测模式，质量扫描范围m/z 125～1 100).
2 结果与讨论
2.1 Glu残基的α-ODmab、γ-ODmab保护基脱除
为了比较Glu的α-ODmab和γ-ODmab的脱保护，以线性肽LγE5(图3)为目标产物，采用Fmoc/tBu/Dmab三维保护策略，设计合成了肽树脂1和2：
肽树脂1：H2N-(-GluOtBu-)4-GluODmab-Resin
肽树脂2：H2N-(-GluOtBu-)4-Glu(ODmab)-Resin
肽树脂1和2分别以Glu的γ-COOH和α-COOH与树脂连接，相应的另一个羧基由Dmab保护，则肽树脂1和2上Dmab的脱除反应分别对应α-ODmab和γ-ODmab的脱保护反应.
肽树脂1和2分别经2% N2H4·H2O脱除Dmab保护基后，裂解肽树脂，得到产物粗肽1和2. 粗肽1经HPLC和ESI-MS分析显示(图4)，主要馏分(tR=14.2 min)的[M+H]+为888.1 Da，与LγE5的理论值888.5 Da相符，即该馏分为LγE5. 粗肽2经HPLC(图5)和ESI-MS分析(图6)结果显示，色谱峰a馏分(tR=13.6 min)的[M+H]+为993.5 Da，色谱峰b馏分(tR=14.0 min)的[M+H]+为888.4 Da(目标肽LγE5的理论值为888.5 Da)，即馏分b为LγE5，而馏分a中含有比目标肽大105 Da的组分.
根据Dmab脱除反应机理(图2)[6]，经肼处理后ivDde首先脱去，随后4-氨基苄基迅速发生自发的消去反应，最终得到自由羧基. 肽树脂1中的α-ODmab脱保护反应完全符合该机理，脱除Dmab后的产物单一(图4). 但是肽树脂2中的γ-ODmab脱保护产物复杂，观察到比LγE5的[M+H]+大105 Da的另一产物([M+H]+为993.5 Da)，恰与LγE5的4-氨基苄酯肽理论值相符([M+H]+为993.2 Da)(图7). 即γ-ODmab在进行保护基的脱除反应时，4-氨基苄基的自发消去反应进行缓慢，造成脱保护反应不完全. JOHNSON等[5]利用Dmab保护基进行环肽合成时也发现了该现象.
2.2 Asp残基的α-ODmab、β-ODmab保护基脱除
为了比较Asp的α-ODmab和β-ODmab脱保护，以线性肽RGD(图8)为目标产物，采用Fmoc/tBu/Dmab三维保护策略，设计合成了肽树脂3和4：
肽树脂3：H2N-D-Phe-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-AspODmab-Resin
肽树脂4：H2N-D-Phe-Lys(Boc)- Arg(Pbf)-Gly-Asp(ODmab)-Resin
肽树脂3和4分别以Asp的β-COOH和α-COOH与树脂连接，相应的另一个羧基由Dmab保护，则肽树脂3和4上保护基Dmab的脱除分别对应α-ODmab和β-ODmab的脱保护反应.
肽树脂3和4分别经2% N2H4·H2O脱除Dmab保护基后，裂解肽树脂，得到产物粗肽3和4. 如图9所示，粗肽3的HPLC分析图谱显示馏分较单一(tR=16.2 min)，ESI-MS分析显示其[M+H]+为974.4 Da，与RGD的理论值974.3 Da([M+H]+)相符，即该馏分为RGD. 而粗肽4经HPLC(图10)和ESI-MS分析(图11)显示，色谱峰c馏分(tR=15.8 min)的[M+H]+为1 079.0 Da，色谱峰d馏分(tR=16.3 min)的[M+H]+为974.0 Da，即馏分d为RGD，馏分c中含有比目标肽大105 Da的组分，参照Glu的Dmab保护基脱除原理(见图2)，推测该组分为RGD的4-氨基苄酯肽.
从上述结果中可知，Asp的α-ODmab保护基脱除反应速度快，反应彻底，但β-ODmab保护基脱除反应不彻底，中间产物4-氨基苄酯的自发消去反应较慢，检测到了RGD的4-氨基苄酯肽(图12)，该中间产物比RGD大105 Da. 但与Glu的γ-ODmab相比，Asp的β-ODmab脱保护效率高一些，因此仅检测到少量的中间产物4-氨基苄酯肽(图10)，而在Glu的γ-ODmab中，4-氨基苄酯肽的含量占多数(图5).
3 结论
通过对固相多肽合成中Glu和Asp的羧基保护基Dmab脱保护反应进行研究，发现当Dmab作为不同位置(α-、β-和γ-)的羧基保护基时，其脱保护难易程度不同. 在常规的Dmab脱保护条件(2% N2H4·H2O/DMF)下，肽树脂上α-ODmab的脱保护反应快速、完全，而β-ODmab、γ-ODmab的脱保护反应较慢，可以检测到中间产物4-氨基苄酯肽，由此推测可能是因为β-和γ-的4-氨基苄酯自发消除反应缓慢造成的. 根据中间产物比例(HPLC峰面积比)推断，γ-ODmab脱保护比β-ODmab脱保护更困难一些. 即当Dmab用作固相多肽合成中的羧基保护基时，脱保护效率依次为α-ODmab > β-ODmab > γ-ODmab.
该规律的发现解释了在固相多肽合成时Dmab保护基脱除不稳定的现象. 同时该结果也表明，作为羧基保护基，Dmab在用于主链环合的环肽固相合成时，是一个非常优秀的保护基；但用于Glu和Asp的侧链保护时，尚有局限性，需要更多的研究以建立高效的脱保护条件.
