【摘要】 目的 分别采用两种液相多肽合成法和固相多肽合成(SPPS)法对具有抗病毒活性的多肽RC-12进行合成工艺研究,通过工艺比较分析以研究其潜在的商业价值。方法 分别采用Tag-OH液相法、BDK-OH液相法及SPPS法合成抗病毒多肽RC-12,并对三种不同的合成工艺进行物料消耗量、“三废”产生量、收率比较。结果 比较Tag-OH液相法和BDK-OH液相法,两种方法的收率相差不大且都优于SPPS法;BDK-OH液相法物料消耗量和“三废”产生量高于Tag-OH液相法,但都远远低于SPPS法。结论 Tag-OH液相法对合成多肽RC-12具有较好的工业研究意义和潜在的商业价值。

【关键词】 多肽;SPPS法;Tag-OH法;BDK-OH法

近年来在动植物、微生物体内相继发现了大量天然肽。哺乳动物中的天然肽主要有抗菌肽和防御素两大类[1]。这些肽通常由感染部位的上皮细胞和中性粒细胞表达,具有免疫调节和抗菌特性。许多天然肽已经被证实具有抗病毒的活性[2],其优点为广谱抗病毒活性及低耐药性。然而,通过天然提取法生产这些多肽成本高、产量低,而直接通过化学合成法生产由于氨基酸序列长 (40～50个氨基酸),导致生产周期长、纯化难度大、生产成本高,并且天然多肽通常稳定性差,易被蛋白酶降解[3]。可行的方法是人工合成保留原有多肽有生物活性的截短肽(10～15个氨基酸)。多肽相比传统药物具有很多优点[4],包括:多肽分子量较小,免疫源性较低,相对于许多大分子类药物来说更为安全;多肽的分子结构相对简单,单体分子的功能较为明确、特异性好,产生副作用的概率较小;多肽的分子较小,合成技术成熟完善,生产成本较低;多肽药物的体内稳定性相对来说比较好,可以多途径给药(如口服、喷雾、透皮吸收等),易于吸收[5]。目前,多肽较少应用于抗病毒临床治疗,而本研究着眼于广谱抗病毒多肽合成方法的研究,并为其他类型多肽合成提供参考。

本研究已经筛选出具有广谱抗病毒活性的多肽RC-12。RC-12作为一种多肽化合物,其合成方法与很多多肽化合物相类似,以往主要通过传统的固相多肽合成法(solid-phase peptide synthesis,SPPS)来进行制备,见图1。SPPS法存在一些缺点[6],包括:SPPS法的载体为不溶的树脂,反应时间过长以及无法有效地通过TLC法实时检测反应是否完全,导致终产品粗产品纯度偏低;SPPS法所涉及的反应均为非均相反应,为了让反应进行完全,需要投入几倍当量的氨基酸,导致原料消耗量过大,工业“三废”产生过多,尤其多肽的肽链过长或偶联反应遇到困难氨基酸导致原料使用量更大、反应时间更长、需要复投、更换反应体系(副反应增加、产物纯度降低)、工业“三废”也大幅度增加,不利于生产成本的控制。用SPPS法制备RC-12得到的粗产品收率为48.96%,潜在的商业应用价值不大。本研究尝试使用有别于传统SPPS法的方法,来进行RC-12的合成,比如日本东京农业大学Kazuhiro Chiba课题组[7]、西北工业大学钦传光课题组[8-10]采用两种使用疏水载体辅助的多肽液相合成法,分别为Tag-OH液相法和BDK-OH液相法。

图1 SPPS法流程图

Tag-OH液相法(Tag-supports-assisted liquid-phase)类似于传统SPPS法,见图2。同样是将多肽C末端的氨基酸与载体相偶联,逐个偶联对应的氨基酸得到所需要的片段,最后裂解得到所需的产物。不同点包括:Tag-OH液相法使用的载体在二氯甲烷、四氢呋喃等非极性溶剂中非常易溶,而在乙腈、纯化水、甲醇等极性溶液中很难溶解,整个反应过程为均相反应,氨基酸等原料的投料比更加合理,工业“三废”产生量大幅度下降,生产成本得到有效的控制;反应在溶液中进行,能通过TLC法实时动态检测反应是否完全和杂质的产生;当反应完全后,向反应液加入乙腈或者其他不良溶剂便可有产物析出,只需要抽滤洗涤便能对产物进行纯化,操作简单,易于处理;载体Tag-OH能回收利用,符合绿色化学的发展理念[11]。

图2 Tag-OH流程图

BDK-OH液相法(BDK-supports-assisted liquid-phase)与Tag-OH液相法相似,见图3。BDK-OH辅助基团替代固相树脂[10],在偶联脱水剂的作用下与N-端Fmoc保护的氨基酸的C-端相连,然后分离纯化、脱除N-端Fmoc、多肽偶联,重复以上步骤,依次偶联相应的氨基酸,得到产物。向产物中加入极性小的烷烃或醚类溶剂,借助BDK辅助基团在溶剂系统中易结晶沉淀的特性,将产物与其他物质分离,对分离后的产物进行过滤、洗涤或重结晶便可得到纯化的产物。整个实验过程中,原料的投料比比较合理,工业“三废”的产生量下降,能通过TLC法实时监控反应是否进行完全,载体能够回收,符合绿色化学的发展理念。

图3 BDK-OH流程图

1 方法与结果

1.1 合成路线 RC-12的合成路线见图4。终产物的结构式和序列式如图5所示。

合成图

图4 RC-12的

图5 RC-12结构式

1.2 Tag-OH液相合成法 称取13.81 g(100 mmol,1 eq)2,4-二羟基苯甲醛用800 mL N,N-二甲基甲酰胺溶于2 L圆底烧瓶[6],加入80.63 g(207 mmol,2.07 eq)1-溴二十二烷、138.21 g(1 000 mmol,10 eq)碳酸钾,N2保护,温度70 ℃过夜,TLC检测反应完全。温度降至室温,将反应液缓慢倒入3 L水中,搅拌下瞬间有大量红棕色固体析出,搅拌1 h。抽滤,用200 mL甲醇打浆洗涤,抽滤,烘干,得灰红色固体,称重74.71 g,收率为98.93%。

将上一步的的产物2,4-二 (二十二烷氧基)用1 500 mL四氢呋喃、150 mL甲醇溶于5 L圆底烧瓶,加入11.05 g(292 mmol,2.92 eq)硼氢化钠,N2保护,25℃反应。反应3 h,TLC检测反应完全。缓慢倒入1 000 mL纯化水淬灭,瞬间有大量气泡和白色固体产生,减压浓缩,得白色固体,用甲醇洗涤,烘干得白色固体2,4-二(二十二烷氧基)Tag-OH (苯甲醇) ,反应路线如图6所示,称重69.65 g,收率为98.21%。

图6 Tag-OH合成路线

称取7.57 g(10 mmol,1 eq)Tag-OH用100 mL二氯甲烷溶于200 mL圆底烧瓶,加入5.57 g(15 mmol,1.5 eq)Fmoc-Met-OH,2.11 g(5 mmol,1.5 eq)二异丙基碳二亚胺,2.44 g(20 mmol,2.0 eq)4-二甲氨基吡啶,N2保护,25 ℃反应6 h,TLC检测反应完全。减压浓缩,得灰白色固体,用100 mL乙腈溶解,抽滤,得灰白色固体,烘干,称重10.84 g,收率为97.21 %。用100 mL四氢呋喃溶解上一步的产物(Fmoc-Met-O-Tag),加入3.41 g(40 mmol,4 eq) 六氢吡啶脱Fmoc,N2保护,25 ℃反应2 h,TLC检测反应完全。减压浓缩,得灰白色固体,用100 mL乙腈溶解,抽滤,测滤液pH值,如果pH值<7,要继续用乙腈洗涤,直到pH值=7。得到中间体1,反应路线如图7所示,称重8.58 g,收率为96.58%。

图7 Tag-OH法合成中间体1

量取100 mL四氢呋喃将中间体1(NH2-Met-O-Tag)溶于200 mL圆底烧瓶,量取25 mL四氢呋喃溶解4.77 g(12 mmol,1.2 eq)Fmoc-Thr(tBu)-OH,依次加入1.62 g(12 mmol,1.2 eq)1-羟基苯并三唑、1.51 g(12 mmol,1.2 eq)二异丙基碳二亚胺,活化3 min,加入到反应液中。N2保护,25 ℃反应4 h,TLC检测反应完全。减压浓缩,得橙黄色固体,用100 mL乙腈洗涤,打浆,抽滤,得灰白色固体,烘干,称重12.13 g,收率为95.7%。

量取100 mL四氢呋喃将上一步的产物Fmoc-Thr(tBu)-Met-O-Tag溶于200 mL圆底烧瓶,加入3.41 g(40 mmol,4 eq)六氢吡啶脱Fmoc,N2保护,25 ℃反应2 h,TLC检测反应完全。减压浓缩,得橙黄色固体,用100 mL乙腈溶解,打浆,抽滤,测滤液pH值,如果pH值<7,要继续用乙腈洗涤,直到pH值=7。得到中间体2,反应路线如图8所示,称重9.92 g,收率为94.86%。

图8 Tag-OH法合成中间体2

接下来连Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH的方法、用量、处理方式和上一步Fmoc-Thr(tBu)-OH的一致。粗产品称重18.11 g,收率为65.24%。

量取200 mL四氢呋喃将产物溶于500 mL圆底烧瓶,加入1.68g(40 mmol,4 eq)一水合氢氧化锂裂解,N2保护,25 ℃反应4 h,TLC检测反应完全,减压浓缩,得灰白色黏稠液体,缓慢倒入到400 mL甲基叔丁基醚中,瞬间有大量白色固体析出,搅拌2 h。抽滤得白色固体,烘干,终产物粗产品称重9.82 g,收率为63.21 %,回收滤液,减压浓缩得白色固体即为载体Tag-OH,烘干、称重4.42 g,回收率为58.28%。

1.3 SPPS法 量取200 mL二氯甲烷溶胀12.66 g(10 mmol,1 eq)CTC树脂1 h,抽取滤液,先用200 mL N,N-二甲基甲酰胺×3次洗涤树脂,每次3 min,再用200 mL二氯甲烷×3次洗涤树脂,每次3 min。量取30 mL二氯甲烷溶解11.14 g(30 mmol,3 eq)Fmoc-Met-OH,加入3.88 g(30 mmol,3eq)N,N-二异丙基乙胺活化3 min,加入到反应液中,2 h反应完全,按N,N-二异丙基乙胺∶甲醇∶二氯甲烷=1∶1∶4的摩尔比,加入甲醇进行盖帽,反应0.5 h,抽取滤液,用200 mL N,N-二甲基甲酰胺×3次洗涤树脂,每次3 min,用200 mL 20%六氢吡啶/N,N-二甲基甲酰胺脱Fmoc5+10 min,茚三酮检测,溶液变蓝色,树脂变成黄色,反应完全。用200 mL N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂,每次3 min,直到pH值=7,获得中间体A,反应路线如图9所示。

图9 SPPS法合成中间体A

量取30 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解11.92 g(30 mmol,3 eq)Fmoc-Thr(tBu)-OH,依次加入4.05 g (30 mmol,3 eq)1-羟基苯并三唑、3.79 g(30 mmol,3 eq)二异丙基碳二亚胺,活化3 min,加入到中间体A(NH2-Met-O-CTC)中。反应2 h,茚三酮检测,溶液变淡黄色,树脂变成无色,反应完全。抽取滤液,用200 mL N,N-二甲基甲酰胺×3次洗涤树脂,每次3 min,用200 mL 20%六氢吡啶/N,N-二甲基甲酰胺脱Fmoc5+10 min,茚三酮检测,溶液变蓝色,树脂变成黄色,反应完全。用200 mL N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂,每次3 min,直到pH值=7,获得中间体B,反应路线如图10所示。

图10 SPPS法合成中间体B

Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH的方法、用量、处理方式和上一步Fmoc-Thr(tBu)-OH的一致。最后用200 mL甲醇×3次收缩树脂,每次3 min,晾干,产品称重11.57 g,收率为50.02%。

按产物的质量与裂解液体积的比例为1∶10配制裂解液,裂解液的成分比例为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶纯化水=95∶2.5∶2.5,N2保护,25 ℃反应3 h,反应完全,进行抽滤、滤液减压浓缩得灰白色黏稠液体,缓慢倒入到400 mL甲基叔丁基醚中,瞬间有大量白色固体析出,搅拌2 h。抽滤得到白色固体,烘干,粗产品称重7.8 g,收率为48.96%。

1.4 BDK-OH液相合成法 量取100 mL四氢呋喃溶解4.28 g(20 mmol,1 eq)4,4-羟基二甲酮于200 mL圆底烧瓶中,并置于冰浴中搅拌0.5 h,反应体系中加入缚酸剂6.8 mL(48 mmol,2.4 eq)Et3N[7]。量取9.2 mL(48 mmol,2.4 eq)二苯基次磷酰氯,滴加加入上述反应体系中,冰浴条件下,反应0.5 h,N2保护,25 ℃反应2 h,TLC检测反应完全,加入20 mL 0.1 mol/L硫酸淬灭反应,旋转蒸发仪减压浓缩除去四氢呋喃并加入40 mL纯化水,加入100 mL乙酸乙酯萃取得到有机相,用无水硫酸钠干燥,抽滤,旋转蒸发仪减压浓缩干后,加入60 mL的乙酸乙酯使样品充分溶解,滴加300 mL正己烷(V乙酸乙酯∶V正己烷=1∶5),体系中出现大量白色沉淀为中间体a,反应路线如图11所示,过滤白色沉淀并干燥得到化合物12.19 g,收率为99.12%[7]。

图11 BDK-OH合成中间体a

量取200 mL甲醇溶解上一步的产物羰基双(4,1-亚苯基)双(二苯基次膦酸盐)12.02 g(20 mmol,1 eq)于500 mL的圆底烧瓶中并于冰浴下搅拌0.5 h,加入0.91 g(24 mmol,1.2 eq)硼氢化钠,N2保护,25 ℃反应2 h,TLC检测反应完全。加入10 mL饱和氯化铵淬灭反应,浓缩除去甲醇加入50 mL纯化水,100 mL乙酸乙酯萃取得到有机相,无水硫酸钠干燥,抽取滤液,滤液旋干后加入10 mL乙酸乙酯使样品充分溶解,滴加加入90 mL正己烷(V乙酸乙酯∶V正己烷=1∶9),体系中出现大量白色沉淀为中间体b,反应路线如图12所示,过滤白色沉淀并干燥得到化合物12.11 g,收率为98.21%。

图12 BDK-OH合成中间体b

量取200 mL二氯甲烷溶解上一步的产物(羟基亚甲基)双(4,1-亚苯基)双(二苯基次膦酸盐)6.17 g(10 mmol,1 eq)于500 mL的圆底烧瓶中,依次加入11.14 g(30 mmol,3 eq)Fmoc-Met-OH、4.86 g(30 mmol,3 eq)1-羟基苯并三唑、4.53 g(30 mmol,3 eq)二异丙基碳二亚胺和0.97 g(8 mmol,0.2 eq)4-二甲氨基吡啶,25 ℃反应2 h,TLC检测反应完全,浓缩加入300 mL乙酸乙酯溶解,加入饱和碳酸钠洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩后用50 mL乙酸乙酯溶解样品,逐滴加入350 mL正己烷(V乙酸乙酯∶V正己烷=1∶7),体系中出现大量白色沉淀,过滤白色沉淀并干燥得到产物Fmoc-Met-O-BDK称重9.42 g,收率为97.11%。

量取60 mL乙腈溶解产物Fmoc-Met-O-BDK于500 mL的圆底烧瓶中,搅拌滴加入20 mL二乙胺(二乙胺∶乙腈=1∶3,25 %二乙胺脱Fmoc保护基),25 ℃搅拌1 h,TLC检测反应完全,减压浓缩除去乙腈及二乙胺,加入200 mL二氯甲烷继续浓缩,连续操作4次除净二乙胺,加入15 mL乙酸乙酯,滴加90 mL乙醚(V乙酸乙酯∶V乙醚=1∶6),搅拌出现大量白色固体,静止5 min,除去上清液,得到脱保护的产物中间体c(H2N-Met-O-BDK),反应路线如图13所示,称重7.2 g,收率为96.26%。

图13 BDK-OH合成中间体c

量取300 mL二氯甲烷将上一步的产物中间体c(H2N-Met-O-BDK)溶解于500 mL的圆底烧瓶,量取30 mL二氯甲烷溶解4.77 g(12 mmol,1.2 eq)Fmoc-Thr(tBu)-OH,依次加入1.62 g(12 mmol,1.2 eq)1-羟基苯并三唑和1.51 g(12 mmol,1.2 eq)二异丙基碳二亚胺,活化3 min,25 ℃反应2 h,TLC检测反应完全,浓缩加入300 mL乙酸乙酯溶解,加入饱和碳酸钠洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩后用30 mL乙酸乙酯溶解样品,逐滴加入180 mL正己烷(V乙酸乙酯∶V正己烷=1∶6),体系中出现大量白色沉淀,过滤白色沉淀并干燥得到产物Fmoc-Thr(tBu)-Met-O-BDK,称重9.42 g,收率为97.11 %。量取60 mL乙腈将产物Fmoc-Thr(tBu)-Met-O-BDK溶于500 mL的圆底烧瓶中,搅拌滴加入20 mL二乙胺(二乙胺∶乙腈=1∶3,25%二乙胺脱Fmoc保护基),25 ℃搅拌1 h,TLC检测反应完全,减压浓缩除去乙腈及二乙胺,加入200 mL二氯甲烷继续浓缩,连续操作4次除净二乙胺,加入15 mL乙酸乙酯,滴加150 mL乙醚,震荡(V乙酸乙酯∶V乙醚=1∶10),出现大量白色固体,静止5 min,除去上清液,得到中间体d[H2N-Thr(tBu)-Met-O-BDK],反应路线如图14所示,称重7.2 g,收率为96.26%。

图14 BDK-OH合成中间体d

接下来Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH的方法、用量、处理方式和上一步Fmoc-Thr(tBu)-OH的一致。称重16.62 g,收率为63.04%。

量取200 mL四氢呋喃将产物溶于500 mL圆底烧瓶,量取20 mL四氢呋喃溶解1.68 g(40 mmol,4 eq)一水合氢氧化锂进行裂解,N2保护反应,25 ℃反应4 h,TLC检测反应完全,进行减压浓缩,用0.1 mol/L稀盐酸调节pH值至7.0～7.5。出现沉淀,对沉淀进行过滤,得到含有粗产品和载体的混合沉淀,混合沉淀释放到200 mL乙醚中,超声震荡搅拌0.5 h,连续操作3次,抽滤得白色固体产物,烘干、称重8.16 g,收率为62.23%。回收乙醚减压浓缩得载体BDK-OH,烘干、称重3.47 g,回收率为56.26%。

1.5 粗产品的质谱图 Tag-OH法、SPPS法、BDK-OH法合成的粗产品质谱分别见图15、16、17。

图15 Tag-OH法合成的粗产品质谱图

图16 SPPS法合成的粗产品质谱图

图17 BDK-OH法合成的粗产品质谱图

1.6 成本计算 本研究计算了三种方法的物料消耗量、三废产生量以及粗产品回收率。Tag-OH液相法和BDK-OH液相法的粗产品回收率相差不大,都高于SPSS法。但BDK-OH液相法的原料消耗量、工业“三废”产生量高于Tag-OH液相法。见表1。

表1 成本

2 讨论

SPPS法并非固态反应(如熔融反应、核裂变反应)那样没有任何溶剂为介质。反应时键连在固相载体上的底物结构处于适当的溶剂中,与外加构件分子及试剂分子在固液两相交界处进行有关的化学反应,反应后滤除溶在溶剂中的过量构件、试剂及副产物,便可得到键连在不溶于溶剂的载体上的产物,最后经适当反应切断Linker键,便将目标产物从载体上释放出来。在用SPPS法制备RC-12的过程中,反应均为非均相反应。为了让反应进行完全,需要投入过量的氨基酸,尤其遇到困难氨基酸时,氨基酸的使用量更大。SPPS氨基酸的消耗量、“三废”产生量远远高于Tag-OH液相法和BDK-OH液相法,成本很高。SPPS法无法通过TLC法实时检测反应是否进行完全和杂质的产生,导致纯度不高,粗产品的收率仅为48.96 %,低于Tag-OH液相法的65.24%和BDK-OH液相法的62.23%,潜在的商业应用价值不大。

Tag-OH液相法和BDK-OH液相法类似于传统SPPS法,辅助基团替代固相树脂,同样是将多肽C末端的氨基酸与载体相偶联,逐个偶联对应的氨基酸得到所需要的片段,最后裂解得到所需的产物。不同的是,Tag-OH液相法反应液加入乙腈或者其他不良溶剂便可有产物析出,只需要抽滤洗涤便能对产物进行纯化,载体Tag-OH能回收利用,符合绿色化学的发展理念,载体回收率为58.28%,产物的粗产品回收率为65.24%。而BDK-OH液相法向产物中加入极性小的烷烃或醚类溶剂,借助BDK辅助基团在溶剂系统中易结晶沉淀的特性,将产物与其他物质分离,对分离后的产物进行过滤、洗涤便可得到纯化的产物,载体能够回收,回收率为56.26%,符合绿色化学的发展理念,粗产品回收率为62.23%。

Tag-OH液相法和BDK-OH液相法的粗产品回收率相差不大,都高于SPPS法,载体都可以回收利用,符合绿色化学发展理念,都具有潜在的商业价值。但是,BDK-OH液相法的原料消耗量、工业“三废”产生量高于Tag-OH液相法。综上所述,Tag-OH液相法具有更高的商业应用价值。

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