实验说明：

慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种，它能够将靶基因导入到一些较难转染的细胞如原代细胞等，并将把基因随机整合到宿主的基因组中，从而大大增加了转染效率，并能够在细胞系中稳定表达若干代，可以进行稳转细胞株的筛选。本protocol以构建ptomo-tdTomato-IRES-puromycin细胞系为例。

实验准备:

准备包装质粒和表达质粒；

生长密度为80%-90的%293T细胞；

待感染的靶细胞(以Mc38为例)

设备耗材:

20mL注射器

0.45μL滤膜

试剂:

.Opti-MEM无血清培养基(Gibco公司， Lot: 31985070）

Lipo 6000转染试剂(Beyotime C0526)

Polybrene(Sigma, H9268)

Puromycin: (Beyotime, ST551-10mg)

表达质粒(ptomo- tdTomato-IRES-puromycin)、包装质粒(PMD2.G ；CMV8.1)

实验步骤:

A 病毒包装

1.293T 细胞提前24h传代(10cm 皿)，控制细胞密度在90%左右密度最佳。按照以下包装病毒(这里以10cm皿为例，不同规格的皿按照相应比例加包装质粒即可)。

2.使用Opti-MEM 稀释质粒: 10cm 的皿一般加入表达质粒10ug,再按照一定比例分别加包装质粒， 此处用的是CMV8.1:5ug; PMD2.G.:2ug，即取上述对应体积的三种质粒加入1ml Opti-MEM培养基中轻轻混匀；若换用别的包装体系可以摸索包装比例。Cas9  4:3:2

3.使用Opti-MEM稀释脂质体Lipo 6000： 1ml的Opti-MEM 加入两倍质粒量的Lipo6000 (即2:*17ug=34uL),轻轻混匀后室温静置5min。

4.将上述质粒混合液与脂质体混合液等体积混匀，室温孵育 20mm。

5.从培养箱中拿出 293T细胞，弃细胞培养液并更换4ml Opti-MEM。

6.将转染混合液（2ml）滴加入培养皿中，轻摇混匀后放入细胞培养箱中。

7. 4-6h更换完全培养基。

B 收病毒及感染靶细胞

1.48h后收集病毒液于4°冰箱保存， 原培养皿再补加5mL完全培养基，继续产病毒，待72h再次收集病毒液。

2.将两次所收集的病毒液2000pm，10min去除细胞碎片。

3. 使用20mL注射器以0.45um滤膜过滤，分装至1.5mLEP管中，标记病毒名称，不立即使用的病毒于-80°C分装保存，避免反复冻融。

4. 从培养箱中取出mc38 (6cm)，弃去培养基，加入2mL病毒液感染，再加入8ug/mL的ploybrene

辅助感染。

5.感染48h后更换完全培养基并加puromycin进行筛选(对于mc38. 可用的筛选浓度为3ug/mL，其他

细胞自行探索最佳筛选浓度)。

6. 持续筛选2周左右直至无细胞死亡为止。

实验注意事项:

1.293T 细胞贴壁不是很牢固，容易从壁上脱落，所有的操作过程要尽量轻柔。

2. 不同细胞的puromycin筛选浓度需要进行摸索和调整，mc38为3ug/mL。

3.病毒尽量避免反复冻融， 一般从-80度取出后一次性用完不再冻融，以免影响病毒活性。