药物发现旨在寻找调节蛋白质功能的化学物质。基于结构的药物发现（Structure-based drug discovery, SBDD）是药物发现的一种途径，其直接根据靶蛋白和候选分子之间的相互作用寻找具有最佳疗效和选择性的药物。因此，对于SBDD来说，蛋白质三维结构在原子水平上的精度对预测相互作用是至关重要的。

解析蛋白质结构时，X-射线衍射（XRD），冷冻电子显微镜（Cryo-EM）和核磁共振（NMR）是三种常用的实验技术，在蛋白质结构解析领域应用、发展了这三种技术的几位科学家都因此获得过诺贝尔奖。这三种技术各自具有不同的特点和适用范围，选择合适的技术取决于研究对象的性质、分辨率要求以及实验条件等因素。

1. X-射线衍射

X-射线衍射技术是鉴定蛋白质结构的金标准。XRD可以实现较高的分辨率，通常可以达到1到2埃。因此，它可以提供非常详细的原子级别的结构信息。然而蛋白质晶体的生长对XRD来说是一个很大的挑战，因为不是所有蛋白质都能够形成高质量的结晶。对于难以结晶的蛋白质，获得合适的晶体可能需要花费大量时间和努力。这也就是为什么当科学家解析出一个新的蛋白质结构通常都可以发CNS的原因。

蛋白质三维结构的精度通常用“分辨率”来表示，单位为埃（Å），分辨率衡量了衍射图像以及计算电子密度图时看到的细节水平。如果晶体中的所有蛋白质都以相同的方式排列，形成一个非常完美的晶体，那么其中所有的蛋白质分子都会以相同的方式散射X-射线，使衍射图能够显示出晶体的精细细节。 另一方面，如果晶体中的蛋白质都略有不同，例如由于局部柔性或运动等产生了结构差异，衍射图案就不会包含那么多的精细的信息。分辨率值为1 Å左右的结构属于高分辨率结构，其晶体是高度有序的，因此很容易在电子密度图中看到每个原子。而分辨率大于3 Å的结构仅显示蛋白质链的基本轮廓，原子的位置只能通过推测得知。不过，大多数由XRD解析的蛋白质结构都介于这两个极端之间。

图源：PDB101

上图为不同分辨率下的myoglobin蛋白的电子云密度图，1.0 Å分辨率下的原子位置清晰可辨；2.0 Å分辨率下虽然每个原子的位置已经无法清晰辨认，但氨基酸残基整体的形状仍然清晰，可以比较准确地确定原子位置；当分辨率来到2.7 Å，氨基酸残基的形状已经变得模糊，准确推断原子位置具有较大困难；对于3.0 Å分辨率的结构，几乎无法从电子云密度图辨认出残基的形状，仅能看到此处有一个残基存在。读者可点击此处的链接自行观察不同分辨率下的电子云形状：1A6M（1.0 Å）、106M（2.0 Å）、108M（2.7 Å）、1S0H（3.0 Å）。

2. 核磁共振

核磁共振技术通过分析蛋白质样品中的信号来解析蛋白质的结构。需要利用特定的同位素标记方法（如15N或13C标记）将目标蛋白质中的一部分原子标记上，再通过2D相关实验如1H-15N HSQC或1H-1H COSY确定原子间的连接关系及三维空间排布。基于实验测得的NMR数据，使用计算方法和算法对蛋白质的结构进行计算和模拟，如分子动力学模拟、模拟退火等得到蛋白质的三维结构模型。

NMR的分辨率通常较低，且一般只能用来分析较小的蛋白质片段的结构，通过多次采样来得到溶液中蛋白质的平均位置。然而，NMR对样品的要求较为灵活，可以提供有关蛋白质动态行为、柔性区域和构象变化的重要信息。

PDBID: 1A13

3. 冷冻电子显微镜

冷冻电子显微镜是近年来高速发展的技术，通过观察蛋白质的冷冻样品中的电子显微图像来解析蛋白质的结构。Cryo-EM技术不需要蛋白质结晶。相反，它使用冷冻技术来固定溶液中的蛋白质构象，从而可以研究非晶态或无规则结构的蛋白质。在过去，Cryo-EM的分辨率不怎么高，通常只能达到几十埃，仅能分辨出蛋白质颗粒的大致轮廓。2017年的诺贝尔化学奖授予了Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson三位科学家，他们三者的工作极大地提高了Cryo-EM技术获得的蛋白质图像分辨率。目前，Cryo-EM技术获得的蛋白结构可达到数埃的分辨率，能够大致看出分子的轮廓与肽链走向。PDB数据库中使用Cryo-EM方法解析出的分辨率最高的蛋白质已经具有原子级的精度，分辨率达到了1.15 Å（PDBID：7A6A），不过，这些高精度的结构仅占极小的比例，大部分结构的精度还处于3-5 Å的中等分辨率下。

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由于无需结晶，也不用解析复杂的核磁共振信号，Cryo-EM在大分子和超大分子的结构解析上非常有优势，如大蛋白质复合物、膜蛋白和病毒等。此外，Cryo-EM还能够提供动态过程的信息，如蛋白质的构象变化。

4. 微晶电子衍射

除了以上提到的三种技术外，近年来一种新的结构解析方法——微晶电子衍射（Micro-ED）——正高速发展起来。该技术可以快速、高分辨率的测定小分子化合物和生物大分子的3D结构。其使用电子作为入射光束，在冷冻透射电镜（cryo-TEM）上获得电子衍射数据。由于Micro-ED采用电子而非光子作为射线，电子相比光子拥有更短的德布罗意波长，因此其与物质作用的强度更强，能够分析很小的晶体并达到很高的分辨率。通常Micro-ED只需使用约100纳米的小晶体，在几分钟内就能完成数据采集。并且数据采集过程可以直接得到电子的相位信息，而无需进行相位重建。数据处理方面，采用常规的XRD解析工具就能解析Micro-ED数据，这更近一步降低了其应用门槛。

Micro-ED数据采集过程

不过，Micro-ED并不太适合大尺寸蛋白的结构解析，其更适用于解析短肽以及小分子化合物。例如天然产物的结构解析或药品生产中对API的分析等。自2013年首次应用以来，已经有数百篇Micro-ED相关的论文发表。

Micro-ED相关论文数量

参考文献

Emma Danelius et al. MicroED in drug discovery, Current Opinion in Structural Biology, 2023 (79): 102523