影响因子：5.3
研究概述：肺癌是全球最常见的癌症之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因。正常细胞主要依赖线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）为细胞活动提供能量。然而，大多数癌细胞则依赖有氧糖酵解并分泌更多乳酸，这种现象被称为“沃伯格效应”。乳酸参与了能量调控、氧化还原缓冲以及脂肪酸代谢调节等生物学过程。乳酸衍生的组蛋白赖氨酸乳酸化是一种新型表观遗传修饰，能够直接刺激染色质中基因的转录。组蛋白乳酸化参与了多种关键的生物学调控。然而，有关乳酸化相关基因在LUAD肿瘤环境中作用的研究仍然有限。在本文中，作者分析了乳酸化相关基因在LUAD中的表达，并开发了一个基于机器学习的最优预后模型。结果表明，乳酸化评分较高的LUAD患者具有更大的免疫逃逸潜力及更低的免疫治疗响应率。随后作者用单细胞RNA测验证了模型基因在LUAD中的表达水平。具体结果如下：
研究结果：
筛选与乳酸化相关的肺腺癌基因及其特征分析
为了识别与肺腺癌（LUAD）乳酸化差异相关的基因，作者从TCGA数据库中获取了541例LUAD样本和59例正常组织样本。通过使用“limma”包进行差异分发现5145个差异表达基因（2593个基因上调，3027个基因下调）。随后，作者将这些基因与327个乳酸化相关基因的集合交叉对比，得到52个候选基因（图A）。进一步通过单因素Cox分析筛选出了26个乳酸化预后相关基因，箱线图显示了这些乳酸化相关基因在肺腺癌和正常组织中的表达情况（图B）。利用STRING工具进行PPI分析，结果显示H2AX、CCNA2、GAPDH和ENO1在PPI网络中表现出广泛的关联（图E）。此外，作者对TCGA数据库中390例样本的乳酸化差异基因（DE-LACAGs）进行了体细胞突变特征分析，结果显示其中120例样本（30.77%）存在显著的突变频率，其中AHNAK、PRKDC和MKI67的突变率分别为12%、7%和4%（图C）。作者进一步分析了LUAD中乳酸化差异基因的拷贝数变异（CNV），结果显示HDGF、NSUN2、CCT5、MNDA和PABPC1具有较高的扩增率，而CCNA2、LCP1和GAPDH则表现出较高的CNV缺失率（图D）。最后，作者展示了乳酸化差异基因在染色体上的位置分布（图F）。
LUAD中乳酸化相关基因（LACAGs）亚群的鉴定
作者利用无监督一致性聚类方法，基于26个乳酸化相关基因（LACAGs）对LUAD患者进行了特定分类。通过热图分析，采用最佳分类（k = 2），将507个LUAD样本分为两类：Cluster C1（n = 194，占38.3%）和Cluster C2（n = 313，占61.7%）（图A）。Kaplan–Meier生存分析显示，与Cluster C2相比，Cluster C1的LUAD患者预后显著更差（图B）。主成分分析（PCA）图进一步表明，Cluster C1和Cluster C2的LUAD样本在LACAG表达上可以清晰区分开（图C）。此外，热图还显示了26个LACAG基因的表达及其与临床病理特征的关系，结果表明大多数差异基因集中于Cluster C1中（图D）。
通过机器学习对差异表达基因（DEGs）进行风险建模
为了探索与LACAGs亚型相关的DEGs在LUAD中的预后价值，作者构建了风险模型以评估其对患者预后的影响。通过单因素Cox回归分析，作者从DEGs中鉴定出359个与预后相关的基因。随后，这些预后相关的DEGs通过LASSO-Cox回归分析进一步筛选（图A），最终保留了21个基因（图B）。最后，通过多因素Cox回归分析建立了一个包含10个基因的预后模型。这10个基因分别是：IGFBP1、CYP17A1、DKK1、KRT81、MS4A1、C11orf16、BCAN、FBN2、ANGPTL4 和 SERPINB7。作者还构建了LACAGs聚类、风险评分及患者生存状态之间的桑基图（图C）。在LACAGs聚类中，LUAD样本的风险评分在Cluster C1中显著更高，而Cluster C1的患者临床预后较差（图D）。随后，作者分别使用TCGA数据作为训练集和GSE68465数据作为验证集。根据风险评分和生存状态绘制的图表显示，随着风险评分的增加，死亡率显著上升（图E）。基于风险分组，Kaplan-Meier（KM）生存分析结果表明，无论在训练集还是验证集中，高风险组的患者预后均显著更差（图F）。此外，作者使用ROC曲线评估了风险评分的预测准确性。训练集中1年、3年和5年的风险评分AUC值分别为0.744、0.734和0.715，而验证集中对应的AUC值分别为0.612、0.598和0.566（图E-F）。
列线图的构建与验证
作者通过训练集和验证集的多因素COX回归分析结果发现，风险评分可以作为LUAD患者预后的独立预测指标（两组均为P < 0.001）（图A-B）。基于性别、年龄、临床分期及风险评分，作者构建了一个预测LUAD患者生存率的列线图（图C）。校准曲线显示，列线图预测的1年、3年和5年总生存率（OS）与LUAD患者的实际观察生存率基本一致（图D）。此外，作者基于TCGA数据库中LUAD的临床特征进行ROC分析，发现风险评分的预后预测能力优于其他临床特征（图E）。
基于风险模型的肿瘤免疫微环境及免疫相关基因的评估
为了确定高风险组和低风险组之间浸润免疫细胞的差异，作者使用ESTIMATE算法发现，与高风险组相比，低风险组的ESTIMATE评分和免疫评分更高（图A）。同时，分析了构建风险模型的10个基因与免疫细胞的相关性（图B）。作者进一步探讨了风险评分与免疫相关特征的关系。ssGSEA分析表明，较高的风险评分与大多数免疫相关特征的水平显著降低相关（图C），包括免疫细胞浸润（如B细胞、HLA、iDCs、肥大细胞、T细胞共刺激、辅助性T细胞、Tfh、肿瘤浸润淋巴细胞以及II型干扰素反应。并且风险评分与中性粒细胞M0型巨噬细胞NK细胞和活化的记忆型CD4+T细胞正相关；与记忆型B细胞及肥大细胞负相关（图D）。
肿瘤突变负荷分析与药物治疗响应预测
在高风险组和低风险组中，作者分析了26个LACAGs的表达情况，发现除了PRAM、MNDA和LCP1以外，其余基因在高风险组中均高表达（图A）。作者使用maftools算法观察了高风险组和低风险组中的突变情况，结果显示高风险组的体细胞突变范围显著大于低风险组。其中，TP53的突变率在高风险组为48%，低风险组为39%；TTN的突变率在高风险组为51%，低风险组为36%；MUC16的突变率在高风险组为41%，低风险组为38%；而CSMD3的突变率在高风险组为44%，低风险组为32%（图B）。此外，作者发现高风险组与低风险组之间的肿瘤突变负荷（TMB）差异具有统计学意义（p < 0.05）（图C）。进一步分析表明，LACAGs聚类C1和C2的风险评分增加时，TMB也显著增加（R = 0.18，p = 0.00096）（图D）。
单细胞RNA测序分析和轨迹分析
作者对单细胞数据进行了降维和聚类分析，使用Seurat工具包进行数据处理，并通过Harmony函数对不同样本的数据进行了批量校正。UMAP降维后，将肿瘤组织分为19个亚群，正常组织分为20个亚组。随后，作者使用SingleR工具对每个细胞亚群进行了注释（图A）。作者计算了10个乳酸化相关风险基因在不同细胞类型中的表达情况，结果显示DKK1主要在上皮细胞中表达，KRT81主要在T细胞中表达，而MS4A1主要在B细胞中表达（图B）。作者利用Seurat中的AddModuleScore功能，评估了每种细胞类型中10个相关风险基因的评分，结果显示肿瘤组织中的B细胞评分显著高于正常组织。这表明该预后模型可能通过调控B细胞影响肿瘤的进展（图C）。通过Monocle 2软件进行伪时间序列分析，鉴定出B细胞分化过程中的5种状态（图D）。有趣的是，随着B细胞分化为浆细胞，MS4A1的相对表达水平逐渐降低（图E）。
敲低LDHA抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭
为了研究乳酸在肺腺癌中的作用，作者首先检测了肺腺癌细胞系和正常人支气管上皮细胞系培养基中的乳酸含量。结果发现，肺腺癌细胞中的乳酸含量显著增加（图A）。进一步检测了6对癌组织和配对的正常组织中的乳酸含量，结果显示肺腺癌组织的乳酸含量显著高于周围正常组织（图B）。此外，肺腺癌细胞系A549和H1975的葡萄糖摄取能力显著高于正常人支气管上皮细胞系（图C）。由于A549和H1975细胞的乳酸含量较高，作者将LDHA的siRNA转染到A549和H1975细胞中，并通过qPCR验证了敲低效率（图D）。随后，选择了siRNA1进行一系列功能实验。CCK-8和克隆形成实验表明，敲低LDHA显著抑制了A549和H1975细胞的增殖能力（图E-F）。Transwell实验显示，敲低LDHA显著减少了细胞的迁移和侵袭能力（图G）。
KRT81在肺腺癌细胞和组织中的表达显著升高
基于GEPIA2数据库，作者发现与347例正常组织相比，KRT81在483例肺腺癌组织中的表达显著上调（图A）。Kaplan-Meier生存曲线表明，KRT81高表达组的预后显著差于KRT81低表达组（图B）。通过qRT-PCR和WB分析了模型基因KRT81在LUAD细胞系和HBE细胞系中的差异表达，结果显示LUAD细胞系的KRT81表达水平显著高于HBE（图C- D）。随后作者进一步分析了12对肺腺癌组织及其配对的正常组织的KRT81蛋白水平，结果显示KRT81在LUAD组织中的表达显著升高（图E）。免疫组化结果显示，KRT81在肺腺癌组织中的表达显著增加，且主要定位于细胞质中（图F）。
敲低KRT81抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并导致G1期阻滞及促进凋亡
由于A549和H1975细胞中KRT81高表达，作者将siRNA转染到A549和H1975细胞中，并通过qRT-PCR验证了敲低的效率（图A）。随后选择siRNA2进行一系列功能实验。CCK-8和克隆形成实验表明，敲低KRT81基因导致A549和H1975细胞增殖能力显著下降（图B-C）。划痕和Transwell实验显示，敲低KRT81显著降低了细胞的迁移和侵袭能力（图D-E）。此外，敲低KRT81基因导致侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达显著下降（图E）。
作者还通过流式细胞术分析敲低KRT81是否导致LUAD细胞周期阻滞及凋亡增加。在A549细胞中，与siNC组相比，siRNA2组中G0/G1期细胞比例显著增加，而S期细胞比例显著下降（图A）。此外，敲低KRT81后细胞凋亡率显著增加（图B）。通过分析凋亡相关蛋白的表达水平，作者发现敲低KRT81显著上调了Caspase3和P53的表达，同时显著下调了Bcl-2的表达（图11C）。这些结果表明，敲低KRT81促进了细胞凋亡。
KRT81通过EMT和PI3K/AKT通路的激活发挥其生物学功能
基于KRT81对细胞侵袭能力的影响，作者进一步研究了敲低KRT81后对上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的影响。结果发现，敲低KRT81后，E-cadherin的表达显著上调，而间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达显著下降（图A）。这表明KRT81通过调控EMT促进了细胞的转移。由于KRT81的表达变化对LUAD细胞表型有显著影响，作者进一步探讨了KRT81在LUAD中的作用机制。通过差异基因分析，作者观察到KRT81的表达水平显著改变了数百个基因。对上调基因进行KEGG富集分析，结果显示这些基因显著富集于PI3K/AKT信号通路及细胞骨架调控通路（图B）。此外，将LUAD中KRT81的mRNA表达水平按照中位值分为高表达组和低表达组后进行GSEA富集分析，结果表明KRT81的上调能够激活PI3K/AKT信号通路（图C）。蛋白质印迹（WB）结果进一步显示，在敲低KRT81后，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白水平显著下降（图D）。这些结果表明，KRT81可能通过PI3K/AKT通路促进肺腺癌的发展。
KRT81在体内促进肿瘤发生
最后作者建立了裸鼠异种移植肿瘤模型，以阐明KRT81在肺腺癌中的体内作用。将转染了siNC或siRNA2的A549细胞注射至裸鼠腋窝部位后，密切监测肿瘤的变化。结果显示，敲低KRT81显著抑制了肿瘤的生长（图A）。敲低KRT81的组别肿瘤体积和重量显著减少（图B）。免疫组化表明，与siNC组相比，siRNA2组中与肿瘤增殖密切相关的KRT81、Ki-67和PCNA蛋白的表达水平显著降低（图C）。为了进一步验证上述结果，作者使用B6-178 KrasLSL-G12D小鼠建立了肺腺癌原位模型，并收集癌组织及邻近的正常组织。免疫组化结果显示，与正常小鼠肺组织相比，KRT81在肺腺癌组织中的表达显著上调（图D）。
研究总结：
这篇研究文章重点探讨了乳酸化相关基因在LUAD中的功能及其潜在的临床意义。作者基于TCGA和GEO数据库数据，对LUAD样本进行了差异表达分析，筛选出26个预后基因，并通过机器学习构建了一个包含10个基因的风险模型。这一模型成功将患者分为低风险组，结果表明高风险组患者预后更差，同时伴有较高的免疫逃逸潜力、TMB和RNAss。通过免疫浸润分析，作者发现高风险组中某些免疫细胞的浸润显著降低。此外，作者通过单细胞RNA测序分析进一步验证了模型基因在肿瘤微环境中的功能，特别是MS4A1在B细胞分化中的关键作用。作者的湿实验还显示LUAD细胞及组织的乳酸含量和葡萄糖摄取能力显著增加，而敲低LDHA能够显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。并且，发现KRT81在LUAD中显著高表达；与患者预后不良相关。通过体外和体内实验，作者发现敲低KRT81能够显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，阻滞细胞周期于G0/G1期并促进细胞凋亡。进一步研究表明，KRT81可能通过调控EMT和激活PI3K/AKT信号通路促进肺腺癌的发展。在裸鼠异种移植模型和小鼠肺腺癌原位模型中，敲低KRT81显著抑制了肿瘤生长。
