最近看文章里写道巨噬细胞对T细胞的影响，其中一个指标CFSE，查看是对T细胞增殖的指标，故来了解其实验原理和方法
1. 实验原理：
荧光染料CFSE， 也可称为CFDA SE（5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester） 即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。
当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。
因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。
2. 配置
用DMSO溶解成5 mmol/L的储存液，于- 20 ℃避光保存。使用时，用无血清DMEM培养液稀释成5μmol/L的工作液备用。CFSE试剂盒内有一小瓶CFSE（A试剂）标明500ug ，另有一小瓶DMSO（B试剂），500ugCFSE溶解于180ulDMSO即是5mM stock solution。
3. 标记细胞
制作细胞悬液，加入等体积CFSE工作液，于37℃孵育10 min，用40%体积的冷小牛血清立即终止标记10min。 离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。
CFSE的浓度国外报道从0.5uM~20uM都有，建议终浓度为2.5-5uM。浓度太低，细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。标记孵育时要经常摇匀。
实验实例
1、分离CD4+T：Ficoll分离人外周血PBMC，CD14磁珠（Miltenyi）阴选其中CD14-细胞，CD4磁珠（Miltenyi）阳选CD4+T细胞，流式检测CD4+T纯度>98%（两步法按照Miltenyi CD4磁珠protocol）；
2、CFSE标记：CFSE试剂购自Invitrogen（C34554）。标记步骤按照试剂protocol，即：定容至1x106个细胞/ml→直接向细胞悬液中加入5mM CFSE储存液，终浓度为0.5uM~4uM→37℃孵育染料10min→使用5倍体积冰上预冷培养基淬灭染料→冰上孵育5min→洗3遍→铺板（96孔板，每孔1x105）；
3、刺激：使用DMEM+10%FCS作为全培，各组分别给予可溶性anti-CD3/28、Miltenyi T细胞活化磁珠（负载anti-CD2/3/28抗体，磁珠/细胞ratio为1:2）、活化磁珠+rh IL-2（100IU/ml）。体外培养3~4天后检测。
