1.研究背景
抗表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体已被批准用于RAS野生型（WT）转移性结直肠癌（mCRC）的治疗，但最初受益于EGFR阻断的患者几乎总是会产生耐药性。从分子学角度来看获得抗性主要有两个主要机制：第一个是涉及EGFR下游（如NRAS和BRAF）的激活突变，第二是依赖于EGFR胞外域结构（ECD）中的突变，这些突变损害了抗体和靶点的结合。作者在之前的研究中表明，在EGFR阻断期间出现在循环肿瘤DNA（ctDNA）中的RAS、BRAF和EGFR突变等位基因在停止治疗后下降。使用西妥昔单抗或帕尼单抗治疗后最初有反应，而后发生疾病进展的患者仍然是未满足临床需求的，这主要有三个原因。首先，复发的分子基础具有特异性，进展时的组织活检无法在临床实践中进行。其次，约40%的病例中出现的KRAS、NRAS和EGFR 胞外域结构（ECD）获得性突变，这些突变通常是高度异质性的，相应的突变蛋白很难在药理学上靶向。第三，对于转移性结直肠癌患者，除二线治疗外的晚期标准治疗方案效果较差，且伴有毒性。在这种情况下，抗EGFR单克隆抗体的再治疗可以作为临床实践中晚期治疗方案。

2.研究目的
CHRONOS试验，这是一项多中心，不设盲，单臂的二期临床试验，评估ctDNA中RAS、BRAF和EGFR 胞外域结构（ECD）突变状态指导帕尼单抗抗EGFR治疗的可行性。主要终点是根据实体肿瘤反应评价标准（RECIST）1.1版的总缓解率 。次要终点是无进展生存率（PFS）、OS，毒性和不良事件通用标准（CTCAE）4.03版中的不良事件。

3.研究内容
CHRONOS试验中仅招募ctDNA中检测的所有突变的水平低于检测值的患者，我们称之为“零突变ctDNA鉴别分类”。共筛选了52例患者，其中27例患者ctDNA中RAS、BRAF和EGFR胞外域未检测到变异的患者进行抗EGFR治疗(见图1)。27例患者既往抗癌治疗中位数为3次，最常用的既往抗EGFR治疗药物是帕尼单抗(15/27，55%)，主要用于一线治疗，所有患者均为微卫星稳定型。

图一

4.研究结果
4.1 RAS/BRAF和EGFR ECD突变的血液检测
使用基于微滴式数字PCR（ddPCR）评估在ctDNA中KRAS、BRAF和EGFR胞外域突变。52名患者中的16人在ctDNA中至少有一种抗EGFR抗性突变。准确的说，13例患者有KRAS，4例有NRAS，1例有BRAF，3例在ctDNA中有EGFR胞外域突变。16名患者中5名同时发生多种突变。RAS密码子61突变是最常见的RAS突变，16例患者中有8例存在此类突变。转移性结直肠癌患者ctDNA中Q61变异的高频率与抗EGFR抗体的二次耐药相关。

4.2 帕尼单抗再用药的临床结果
根据”零突变ctDNA鉴别分列”要求，36例患者符合进行帕尼单抗再用药的条件。其中27人按照试验方案接受了药物治疗。液体活检筛查和第一次帕尼单抗再注射之间的中位时间是21天。该试验主要终点为总缓解率，8个患者部分缓解（PR）即总缓解率为30%（见图2），部分缓解患者中位持续时间为17周。27例患者中11例达到病情稳定（SD），11例患者中9例持续4个月以上。因此63%的患者获得了疾病控制（PR+SD>4个月）。考虑到患者曾经接受并失败的系统治疗方案的中位数为三次，就肿瘤收缩率，以及帕尼单抗所达到的效果与三线标准治疗如瑞格非尼或三氟尿苷-替吡拉西相比效果良好且显著。安全性分析结果显示至少接受过1剂帕尼单抗的患者，没有因不良反应中断治疗，也没有退出治疗，且未发现5级不良事件。

图二

4.3 ctDNA中抗药性突变检测
有人认为动力学数学模型的时间阈值可以用于定义转移性结直肠癌患者使用抗EGFR抗体在治疗的最佳时间。作者计算了每个患者的筛查时间间隔（STI），定义为最后一次抗EGFR用药与CHRONO临床试验筛查日期之间的时间间隔（见图3）。中位STI为11.5个月。没有特定的时间阈值可以用来区分ctDNA突变患者和野生型患者。此外STI的长度与响应率之间没有相关性，进一步表明“零突变ctDNA鉴别分列”是抗EGFR再治疗效力的主要预测因素。总体而言，这些观察结果表明，使用特定时间阈值对于临床选择再治疗患者病例是无效的，而ctDNA检测可以判断潜在患者。

图三

4.4 抗EGFR再治疗后的分子图谱分析
作者研究了帕尼单抗再用药之前收集的福尔马林固定石蜡包埋样品，以及帕尼单抗再用药组，基线和疾病进展时期收集的ctDNA（图4）。
对帕尼单抗再次用药前获得的石蜡包埋样本进行NGS分析，发现2例患者存在ERBB2扩增（INT-001和NIG-012），其中一例（INT-001）也存在ERBB2p.V777L突变（图4上部）。作者和其他人之前报道过ERBB2突变导致结直肠癌对EGFR阻断治疗产生抗性。值得注意的是INT-001和NIG-012对帕尼单抗最佳反应为疾病进展。
CHRONO临床试验中27个患者中的18例保存有足够的基线时期血浆用于ctDNA NGS panel分析。分析发现在一部分患者中，存在先前与EGFR阻断抗性相关的MAP2K1，PTEN，SMAD4和PIK3CA突变（图4中部）。
CHRONO临床试验中27例患者中的21例保存有再次给药后疾病进展时收集血浆用于NGS panel分析。NGS分析显示15例患者至少有一个与EGFR阻断抗性相关的遗传改变。在21例患者中的10例中可以观察到最常见的耐药机制EGFR，KRAS和NRAS基因突变或扩增（图4下部）。KRAS和NRAS突变经常发生在61位。在四名患者中发现了PTEN无意义突变，在三名患者中检测到MET扩增。在21名患者中，至少有10名（48%）患者中找到抗EGFR治疗的两种改变。在5例可评估ctDNA分析并达到部分缓解的患者中，3例（INT-005，NIG-006和IOV-003）显示耐药突变，分别达到28周，28周和21周的PFS。其他两个ctDNA可评估的部分缓解患者在进展时ctDNA没有突变（IOV-009和NIG-001），PFS分别达到20周和27周。值得注意的是，对再用药治疗中没有临床反应的患者的血浆中也经常检测到耐药突变，表明抗EGFR抗体也对在CHRONOS治疗中不能获益的患者施加生物压力。

图四

注：译文仅供参考,如有疑义应原文为准
原文链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9386661/