操作步骤

1. 请自行准备：无水乙醇、1.5mL RNase-free 灭菌离心管。

2. 取出洗涤液，按以下操作：

a) 洗涤液 A：按终浓度 30%的比例加入无水乙醇，如 7mL 加入 3mL 无水乙醇；14mL 加入 6mL 无水乙醇，充分混匀。

b) 洗涤液 B：按终浓度 85%的比例加入无水乙醇，如 1.5mL 加入 8.5mL 无水乙醇；3mL 加入 17mL 无水乙醇，充分混匀。

c) 配制好的洗涤液如出现沉淀，可在 37℃溶解，摇匀后使用。

3. 取无 RNA 酶的 1.5mL 离心管，加入 200μL 样本，200μL miRNA 释放剂及 20μL 消化液，充分混匀，65℃水浴 10 分钟。

4. 加入 5μL miRNA 富集剂，0.85mL 无水乙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响 RNA 的提取与后续实验。

5. 将吸附柱放入收集管内，将 650μL 上述溶液转入吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液；将剩余溶液转移至吸附柱内，12,000rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

6. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 A 至吸附柱内，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

7. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

8. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

9. 按每份样本 30μL 取洗脱液（如 10 份提取样本，即取 300μL 洗脱液），放置于灭菌 1.5mL 离心管，65℃预热。

10. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 离心 2 分钟，离去残留的洗涤液。

11. 取出吸附柱，放入新的 1.5mL RNase-free 灭菌离心管内，开盖，室温放置 2 分钟。

12. 在吸附柱中心加入 30 μL 预热洗脱液，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，收集 miRNA 溶液。提取的 miRNA 即可用于下一步实验或-70℃保存。

注意事项

1. 为防 RNA 酶污染，实验过程中最好戴一次性干净手套、口罩，使用处理过的无 RNA 酶的容器和无 RNA 酶的超纯水 。

2. 血清血浆中 miRNA 含量较低，难以用 NanoDrop 测量其浓度，建议直接进行 RT-PCR 或 RT-qPCR 分析。

3. miRNA 释放剂、洗涤液含有刺激性化学物质，请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时请就医。

4.提取的 miRNA 如暂不使用，应-70℃保存，可适当加入 RNA 保护因子（货号：51090，一般 40μLRNA 溶液加入 2μL）。