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Basic Information

• 英文标题： The diversification of methods for studying cell–cell interactions and communication
• 中文标题：研究细胞-细胞相互作用和通信方法的多样化
• 发表日期：18 January 2024
• 文章类型：Review Article
• 所属期刊：Nature Reviews Genetics
• 文章作者：Erick Armingol | Nathan E. Lewis
• 文章链接：https://www.nature.com/articles/s41576-023-00685-8

Abstract

1. 没有细胞是生活在真空中的，细胞间的分子相互作用定义了大多数表型。
2. 转录组学提供了丰富的信息来推断细胞-细胞间的相互作用和通讯，从而加速发现细胞在群落中的角色。
3. 这类研究在很大程度上依赖于推断哪些细胞在相互作用以及涉及到的配体和受体的算法。
4. 不同研究领域的特定压力正在推动下一代计算工具的进化，实现了新的概念机会和技术进步。
5. 现在更复杂的算法可以考虑到细胞的异质性和空间组织，多种配体类型和细胞内信号传导事件，并使得使用更大、更复杂的数据集成为可能，包括单细胞和空间转录组学。
6. 同样，新的高通量实验方法正在增加可以同时分析相互作用的数量和分辨率。
7. 在这里，我们探讨了细胞-细胞相互作用研究的最新进展，并突出了下一代工具的多样化，这些工具为不同的应用产生了丰富的工具生态系统，并正在实现无价的发现。

Introduction

para

1. 细胞-细胞相互作用（CCIs）是多细胞生命的基石，它使细胞能够存在于社群中并执行集体功能。
2. 细胞通过产生多种分子和膜结构来与其他细胞相互作用，激活其他细胞中的信号传导途径。
3. 这些相互作用协调基因表达，然后驱动细胞功能。
4. 这些相互作用涉及结构性和功能性的蛋白质、小分子化合物、细胞外基质、膜突起和细胞外囊泡。
5. 然而，与在其他细胞上的同源受体结合的配体，或配体-受体相互作用（LRIs），是用于细胞-细胞相互作用的占主导地位的机制。
6. 由LRIs介导的细胞相互作用，专门用于传递信号，也被称为细胞-细胞通讯（CCC），但为了简单起见，我们只将这种特定亚型简称为CCIs。

para

1. 在过去的十年里，人们对研究细胞间通讯（CCIs）的兴趣日益浓厚，以了解调控组织生理学、疾病和发育的分子机制。
2. 特别是转录组学，已经成为大量计算方法的基础，这些方法捕捉CCIs的不同方面，例如参与的细胞类型和涉及的分子机制。
3. 为了支持这些CCI分析，建立高置信度的蛋白质-蛋白质相互作用（LRI）数据库至关重要，其中包括蛋白质亚基、激活剂、抑制剂和/或竞争剂，甚至下游靶基因以捕捉细胞内基因调控。
4. 此外，尖端的实验方法正在使CCIs的高通量分析成为可能，这导致了新的生物学发现，并帮助改进和验证计算工具。

para

1. 已经开发出各种各样的计算工具，它们通过已知的LRIs来推断样本中的CCIs。
2. 这些核心方法使用配体和受体的表达水平来阐明细胞是如何进行交流的，从而产生新的生物学假设。
3. 简而言之，作为一个通用示例，可以如下预测CCIs：首先，将基因表达矩阵过滤，只包括配体和受体。
4. 其次，汇总特定细胞类型（例如通过在单个细胞中平均表达水平）的所有单个细胞中每个基因的表达水平。
5. 第三，对于样本中的每一对细胞类型，评估每一对候选LRIs，通过考虑发送细胞类型中的配体表达水平和接收细胞类型中的受体表达水平。
6. 最后，分别为每一对细胞类型的每个LRIs计算一个通信得分（例如，这可以是发送者-接收者细胞类型对中的配体和受体表达水平之间的乘积、平均值或几何平均值）。
7. 为了进一步确定假设驱动的CCIs（例如确定细胞类型特异性的LRIs），可以进一步进行包括排列、参数和非参数测试的统计分析来识别显著的相互作用。
8. 因此，计算工具能够识别重要的CCIs，并生成可以通过实验评估的生物学假设。

para

1. 几种核心工具已经帮助揭示了众多重要的细胞-细胞相互作用（CCIs），并且新的工具正在出现以应对更加复杂的细胞间相互作用的细微差别。
2. 例如，信号事件在细胞之间有所不同，甚至在同一细胞类型内部也是如此。
3. 此外，适当的相互作用依赖于细胞的邻近性以及多种类型的分子（如蛋白质、代谢物等）。
4. 总的来说，CCIs受其发生的生物学背景或条件的影响。
5. 因此，下一代工具现在通过考虑这些方面的一些问题，更好地模拟了CCIs（见图1a）。
6. 事实上，这些CCI工具已经变得更加精细，通过考虑完整的单细胞分辨率和CCIs的异质性；更加局部化，在空间上定位细胞；更加深入，通过扩展配体类型并评估CCIs的细胞内事件；以及/或更广泛，通过将CCI分析扩展到多个样本和/或生物学条件（如患者、治疗方法、生活阶段和基因型背景）。

Fig. 1: Methodological advancement of cell–cell interaction research.

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• 广泛的计算工具已经被开发出来，用于从基因表达推断细胞-细胞相互作用（CCIs）。
• 最近的技术创新扩展了这种分析的能力，以考虑单细胞相互作用的更精细的分辨率、空间信息、更大的数据集和更深层的信息。
• 实验方法扩展了传统方法的威力，提高了追踪CCIs的通量。

para

1. 传统的实验通常用于验证CCI预测，往往聚焦于中介分子的共定位，包括诸如荧光原位杂交、荧光共振能量转移和免疫染色等技术。
2. 尽管这些方法允许对特定的相互作用伙伴进行假设驱动的 study，但尖端的高通量技术可以同时追踪大量的相互作用，实现一种无假设的方法。
3. 这些技术阐明了物理CCI，其分辨率横跨细胞-细胞接口到系统性的CCI网络，例如揭示了CCI的物理网络、参与特定细胞-细胞接触的不同生物分子、新的LRIs和通信机制，以及复杂的信号活动。
4. 因此，这些技术是扩大CCI研究规模并验证下一代计算工具的关键。

para

1. 之前的综述介绍了推断CCI的概念、收集和构建LRI数据库、实施分析工作流程以及了解工具使用的数学和统计策略。
2. 在这里，我们回顾了计算和实验工具如何最近发展以改进CCI研究（图1），提供了一个广泛的工具目录。
3. 我们首先突出了不同下一代计算工具的定义特征、它们的局限性、示例应用以及由此产生的发现。
4. 接下来，我们介绍了具有更高通量的前沿方法，其中每一种都允许研究人员实验性地追踪CCI。
5. 我们描述了它们所支持的研究类型，以及它们如何帮助完善计算工具并使其更准确。
6. 最后，我们讨论了该领域的挑战和未来的发展方向。

Next-generation computational tools

1. 各种核心工具，例如CellPhoneDB和CellChat，建立了一套被社区用来从转录组学推断细胞间通讯（CCIs）的方法。
2. 这些‘核心工具’基于配体和受体的表达，通过核心评分函数（例如表达平均值、表达乘积、表达相关性、基于表达的Hill函数和差异组合）来推断CCIs，而没有被设计来特别解决图1a中显示的任何方面。
3. 然而，概念性的机会和技术进步现在正在推动计算工具的进一步演变，这些工具正在适应不同研究领域的特定压力（见图2）。
4. 在这里，我们讨论这种演变的特征以及它们如何通过采用基于规则和数据驱动的策略（见框1）来满足特定需求，以解答额外的生物学问题。

Fig. 2: Phylogenetic tree of computational tools for inferring cell–cell interactions.

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• 计算工具，用于推断细胞-细胞相互作用（CCIs），已经从一系列核心工具的“根源”发展而来。
• 从这一根源出发，方法变得更加专业化，以解决特定的机遇（中心位置的灰色箭头）。
• 从中心向外延伸的主要分支代表了工具的主要特征（“核心工具”，“更精细”，“更深入”，“更广泛”，“更局部化”或“其他改进”）。
• 彩色框表示每种工具或工具子群的次要特征（彩色阴影）。
• 共展示了105种工具（详见补充表1以获取更多详细信息，包括摘要和存储库可用性）。
• 工具的分组如下：“核心工具”依赖于核心或类似的评分函数，并且是CCI分析的一般框架；其他分支捕捉具有主要特征的工具，如图1a所示（其他分支的次要特征在补充表1中进一步展示）；“其他改进”突出了其主要特征未在图1a中显示的工具（例如，实现交互式界面，启用基准测试，并专注于同时推断多个配体-受体相互作用（LRIs）以推断CCIs）；分支和叶子根据底层算法的相似性，次要特征或发表日期进行排序，定义了不同的子组（彩色框和阴影）。
• 在撰写本综述时以预印本形式发表的工具用星号标记。
• 如果同一工具的多个版本包含不同的特征并且发表在不同的文章中，则将它们视为独立的版本。
• DE，差异表达。

框1 基于规则和数据驱动的计算策略

• 细胞-细胞相互作用（CCI）工具利用多种计算策略，许多可以分为基于规则和数据驱动的方法（见补充表1）。基于规则的工具（如SoptSC19、NICHES44、ICELLNET39和NATMI125）结合了对CCI行为的假设或先验知识。它们使用与配体和受体数量相关的原则来建模相互作用（如配体和受体表达的阈值，或使用表达水平作为描述相互作用模式的连续核心函数的输入7），或者通过定义相互作用规则（如基于代理的模型）。然而，基于规则的方法可能在适应更高的CCI复杂性，噪声数据和未考虑的变量方面遇到困难。相反，数据驱动的工具主要使用统计测试或机器学习（如差异分析、标签置换、回归模型、分解方法和深度学习）来解释基因表达。这些方法可以揭示大型数据集中意想不到的相关性和隐藏模式，即使基础机制尚不完全理解（如涉及非配体-受体相互作用（non-LRIs））。例如，DIALOGUE121、MISTy57、MOFAcell122、scITD120和Tensor-cell2cell（参考文献33）使用不同类型的分解方法来提取CCIs的特性，尽管它们需要大量数据。

• 基于规则的工具通常由于依赖于基因表达公式而产生一致的结果。相比之下，由于统计测试（如置换）的内在随机性和机器学习算法（如基于梯度的方法）的初始化，数据驱动的工具可能在相同数据集上生成不同的输出。数据驱动模型的可重复性和稳健性可以通过使用相似性度量来评估和稳定同一工具的不同运行结果来改善，无论算法的随机性如何33,204。混合模型通过结合两者的优点来利用基于规则和数据驱动策略。例如，CellChat17和CellPhoneDB16首先通过基于表达的公式推断CCI以确保一致性，然后使用统计测试提取显著的LRIs7。

• 尽管输出不同，这两种工具类型都促进了各种下游分析。基于规则的方法的结果可以直接比较顶级LRIs、CCI过表达分析、细胞类型聚类和信号功能评估17,44,45,103,105,106,135,137。同时，来自深度学习和分解方法的数据驱动输出将数据压缩成负载和/或嵌入，可以进一步分析。例如，代表多细胞程序（MCPs）或CCI模式的主成分或因子可以帮助聚类和排序样本、LRIs和细胞对，并通过富集分析关联生物功能33,121,187,205。工具输出也可以作为其他机器学习工具的输入，分类样本或LRIs33,121,187,206,207。理解每种CCI工具类型对于识别优缺点、输出行为和潜在下游分析至关重要。

Finer: gaining insights at full single-cell resolution

更精细：在完整的单细胞分辨率下获得洞察力

para

1. 利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）的计算工具主要在伪批量水平上应用，其中将单个细胞聚集到簇或细胞类型中。
2. 这种方法有效地处理了scRNA-seq中每个细胞测量的转录物通常的稀疏性。
3. 然而，最新的方法现在可以在真正的单细胞分辨率下处理这些数据（图2和补充表1），推断单个细胞对之间的通信。

para

1. 在单细胞分辨率下推断CCI并不依赖于基因的簇平均值表达。
2. 在这方面，SoptSC19考虑了单细胞CCI；然而，其主要焦点是评估由LRIs触发的细胞内信号传导活动。
3. 其他工具，如NICHES44和Scriabin45，利用核心工具7应用的方法，以无标记的方式直接从单细胞对计算LRIs，并进一步扩展了单细胞CCI的应用、输出和可视化选项。
4. SPRUCE46和DeepCOLOR47将单个细胞的基因表达投射到潜在空间，并利用这些信息推断单细胞对之间的CCI。
5. 此外，它们还促进了从低维数据进行的下游分析，而不会引入由细胞类型注释带来的不希望的偏差。
6. 这样，这些下一代方法利用了在汇总细胞时之前被忽略的生物洞察。

para

1. 在单细胞分辨率下分析细胞间通信提供了深入了解单个细胞之间以及细胞群内部的交互异质性的洞察。
2. 例如，NICHES评估了单个细胞对使用的配体和受体（图3a），从而揭示了另一层异质性，并更好地定义了使用不同分子机制的细胞亚群。
3. 同样，Scriabin帮助揭示了肿瘤微环境中单个T细胞与CD1C+树突状细胞之间相互作用的多样性。
4. 在这种情况下，发现耗竭表型并非仅限于离散的细胞亚型簇；相反，它存在于多个簇中（图3b）。
5. 重要的是，非耗竭型和耗竭型T细胞与CD1C+树突状细胞的相互作用方式不同，耗竭型T细胞通过CTLA4和TIGIT进行交互，同时减少了其促炎趋化因子如CCL4和CCL5的表达。
6. 因此，这些方法可以捕捉到可能被典型的聚合工具忽略的单细胞特性和生物现象的异质性。

Fig. 3: New features and analyses performed by next-generation computational tools.

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• 在单细胞分辨率下分析细胞-细胞相互作用（CCIs）可以使人们识别定义细胞对异质性的配体-受体相互作用（LRIs）（标记）。
• 单细胞CCIs还有助于获取与它们的通讯机制相关的更精确注释。
• 同样，分析单细胞之间的相互作用（圆圈）可以揭示与细胞注释不相关的表型异质性（不同颜色）。
• 考虑到空间转录组学的工具探索细胞的局部邻域，从而可以在空间上可视化信号活动（c）并基于受体的空间分布和/或配体的扩散推断信号通路的方向性（d）。
• 整合基于代谢物或小分子的LRIs的策略依赖于催化它们生产或消耗的酶的表达。
• 包括基因调控网络和受体下游转录因子可以帮助推断两个细胞之间的信号反馈回路，从而捕捉到细胞内活动的相互连接的层次。
• 下一代工具还允许比较多个条件，要么成对地检测不同的CCI变化（g），要么同时识别CCI的趋势或模式（例如，来自因子分解方法的因素）（h）。

1. 在推断单细胞之间的相互作用时存在挑战。这些挑战包括如何处理丢失的数据或零计数以及如何将分析扩展到更大的数据集。
2. 为了处理数据稀疏性，可以在推断细胞间通讯之前使用去噪算法。
3. 此外，Scriabin和NICHES使用保留零的通讯分数来避免改变数据稀疏性。
4. 为了处理单细胞数据集中的大量细胞，NICHES通过对细胞进行抽样来降低计算需求；然而，这个过程会因为遗漏有效数据并引入随机抽样的噪声而降低统计功效。
5. 或者，Scriabin可以根据感兴趣的属性优先考虑细胞对，或者可以将它们总结为一个整体潜在相互作用的网络，从而减少对计算内存的需求。
6. 同样，DeepCOLOR优先考虑在空间点中共定位的细胞。
7. 与其他扩展到数十万细胞的工具相比，SPRUCE由于其低维性质，独特地更能扩展到超过1000万个细胞对，从而能够生成大型细胞间通讯图谱。

More localized: spatially contextualizing cells

更局部化：在空间上下文中定位细胞

para

1. 细胞位置影响细胞间相互作用以及相关的基因表达。
2. 介导细胞间通讯的分子在从产生它们的细胞扩散时形成浓度梯度，并在接收细胞中触发不同的信号传导程序。
3. 因此，为了理解组织如何运作，考虑细胞的空间背景是很重要的。
4. 例如，当把空间信息整合到单细胞转录组学中时，可以在肝细胞中观察到劳动力的空间划分。
5. 因此，新的细胞间通讯工具，检查每个细胞的空间背景，将更清晰地解析复杂组织中具有生物学意义的通讯。

para

1. 空间转录组学领域的蓬勃发展鼓励了计算工具的进化，以在推断细胞间通讯（CCIs）时包括细胞位置49,50,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82（图2和补充表1）。
2. 这些工具中的一支更一般性地促进了空间数据分析55,56,57,58。
3. 例如，Giotto55和Squidpy56帮助用户可视化空间数据，并跨细胞或点进行诸如聚类和邻域检测的分析，但这些也提供了用于CCI推断的信息（图3c）。
4. 其他如MISTy57之类的框架通过多个‘视角’识别空间数据的更特定属性；即，以领域特定方式描述标记物表达关系及其变异源的模型。
5. 每个‘视角’包含给定距离阈值的不同范围的细胞间距离，这有助于识别CCI的特定生态位机制。
6. 这种方法已经帮助识别出区分乳腺癌活检样本的肿瘤等级和临床亚型的特征，同时还揭示了关键的信号通路57。

para

1. 更专业的空间CCI推断从较早的工具开始，如SVCA59和SpaOTsc76，分别考虑单个基因和单细胞之间的相互作用。
2. 现有的工具直接整合了细胞间距离，要么限制分析到邻近的细胞和点59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,82，要么加权表示相互作用潜力的通讯分数70,71,72,73,74,83。
3. 例如，SpaTalk63通过使用细胞之间的欧几里得距离来构建基于它们的K近邻的细胞图网络，从而在空间上限制分析。
4. 然后，它计算连接细胞（即，邻近细胞）的CCI。
5. 另一种方法，COMMOT67，限制距离以推断邻近细胞之间的CCI。
6. COMMOT引入了一种集体最优传输算法84，该算法使用指定的距离限制来定义邻域并推断邻近的CCI。
7. 该算法寻找在位置之间传输一组资源（如配体）的最有效方式，同时在考虑源和目的地（例如，发送和接收细胞）之间的距离时最小化总体成本。
8. 在数学上，它在给定细胞间距离（成本）的情况下优化基于LRI的CCI的潜力（传输计划），同时还对未传输或‘未使用’的配体和受体进行惩罚。
9. 此外，该算法可以同时处理多种竞争的配体和受体种类，并且可以推断空间信号的方向性（图3d）。
10. 其他工具，如stMLnet71，不是限制分析，而是加权相互作用潜力。
11. 例如，stMLnet通过假设细胞间距离与配体浓度之间的反向关系，利用配体扩散原理，通过将通讯分数与细胞间欧几里得距离作为分母来缩放。
12. 这些不同的方法突显了在CCI分析中可以明确考虑距离的多种不同方式。

para

1. 深度学习也帮助探索了细胞间通讯接口（CCIs）的空间属性（方框2），使用了基因表达矩阵和空间细胞图，这些图连接着相邻细胞47,73,79,80,—81,85。
2. 例如，DeepLinc80实现了一个自动编码器，在考虑了表达和细胞图输入之后，推断出一个CCI网络。
3. 这个模型与其他模型的不同之处在于，它揭示了近距离和远距离的相互作用；后者往往会被专注于细胞邻近区域的方法所忽略。
4. 另一个工具，spaCI81，使用编码器生成潜在特征。
5. 通过考虑基因-基因共表达，这个工具可以处理空间转录组学中的缺失，并推断出任何基因对的LRIs和相互作用，例如上游转录因子及其目标配体或受体。
6. 尽管许多基于深度学习的工具可以使用类似的输入，但它们在构建神经网络的方式上有所不同（方框2）。
7. DeepLinc结合了一个变分图自动编码器和一个对抗网络进行正则化80，使得可以推断未观察到的CCIs（如远距离CCIs）。
8. 同时，spaCI分别使用两个单独的编码器处理基因表达信息和空间数据。
9. 然后，第三个编码器使用其他两个编码器的输出，解析基因-三元组关系，这可以检测介导LRIs的上游转录因子81。
10. 因此，深度学习方法可以揭示生物学上有意义的信号活动。

para

1. 其他研究已经证明，可以从配体和受体的表达中解读细胞的空间组织。
2. 例如，Neighbour-seq78通过推断形成多聚体的细胞，从单细胞RNA测序数据集中找到丰富的细胞-细胞接触，从而创建物理细胞-细胞相互作用的网络。
3. 这种策略在脾脏、小肠和肺部，以及在胰腺和皮肤癌中识别出细胞-细胞相互作用的结构。
4. 同样，CSOmap50使用每一对配体-受体来计算每对细胞的亲和分数。
5. 然后，将细胞对投射到一个伪物理空间中，揭示它们在组织内的相对位置。
6. 因此，这些工具利用细胞-细胞相互作用来空间地解释细胞功能，而无需使用空间位置作为输入。
7. 细胞-细胞相互作用也已在秀丽隐杆线虫的全身体水平上重建。
8. 通过使用cell2cell（参考文献49），发现细胞-细胞相互作用与细胞间距离之间存在负相关性。
9. 这种方法使用遗传算法优先考虑在身体不同区域对细胞功能具有启示意义的细胞间相互关系。
10. 因此，这些方法也可以提供关于细胞间相互关系如何编码空间信息以驱动细胞的三维组织结构的假设。
11. 利用这些结果，一种新的基准方法评估高分的细胞间相互关系是否在空间上接近的细胞对中富集。
12. 这种策略可能有助于调整工具以生成具有生物学意义的预测，但也可能模糊涉及长距离相互作用和通过循环系统传播的信号的生物学过程。

框2 深度学习与细胞-细胞相互作用推断

• 深度学习方法在计算生物学中迅速扩展208。这些模型模仿大脑的神经结构，使用互连节点（神经元）从数据中学习。著名的神经网络架构（见图）包括前馈神经网络（FNNs）（a）、卷积神经网络（b）、循环神经网络（c）、自编码器（d）、图神经网络（e）、生成对抗网络（f）和变换器（g）。每种架构都可以为不同目的进行定制。自编码器通过使用基因表达预测配体-受体相互作用（LRIs）46 并整合空间信息47,79,80,81,85，已在细胞-细胞相互作用（CCI）推断中有所帮助。同样，图神经网络可以直接从单细胞138 和空间转录组学62,79 推断CCI。其他深度学习在CCI中的应用包括使用FNNs从基因-基因相互作用114 推断CCI、预测受体转换率150 和从数据中推断高质量的LRIs，而不是依赖数据库147,148。大型语言模型209（LLMs）— 设计用于使用生成预训练变换器处理和生成文本 — 在计算生物学中被证明是非常有价值的210。实际上，专门的基于变换器的模型在单细胞组学的特定任务中超过了先前模型的性能。例如，DeepMAPS211 实现了一个图变换器，可以同时从多种组学推断生物网络。LLMs如scGPT212和scFoundation213，经过数千万单细胞转录组的训练，可以提取细胞模式并增强下游分析，例如细胞类型注释、基因表达增强和药物/干扰反应预测。这些模型及其下游分析能力在单细胞和空间层次上的CCI分析中显示出巨大的潜力。此外，还有机会专门设计LLMs用于研究不同细胞环境中的CCI，通过从一开始就整合LRIs、基因表达和空间数据。这两种策略为更先进的以CCI为重点的LLMs提供了强大的机会，能够处理更大量的数据并实现更好的性能。

Deeper: peering into intracellular activities

更深入：窥视细胞内活动

para

1. CCIs涉及多种类型的分子，包括离子、小分子、肽和蛋白质。这些分子在细胞外（例如对于LRIs）和细胞内（例如对于信号传导、基因表达的调控和配体生物合成）都很重要。
2. 然而，基于转录组学的工具通常仅限于推断蛋白质配体，其丰度与基因表达的相关性大于其他类型的配体。尽管如此，系统生物学通路分析方法可以加深对细胞内过程的了解，以推断其他类别配体的丰度和活性，从而扩大CCI工具的功能（图2和补充表1）。

para

1. 为了估计涉及非蛋白配体（如小分子）的CCI（图2），下一代工具可以分析产生或消耗代谢物配体的酶的表达，从而捕获它们的通讯潜力（图3e）。
2. MEBOCOST91整合了一个经过整理的代谢物-受体和代谢物-运输相互作用数据库，以推断基于代谢物的CCI。
3. 这个工具被用来阐明epsins在巨噬细胞介导的代谢调控中的作用，揭示epsins通过CD36促进动脉粥样硬化巨噬细胞的脂质摄取。
4. 特别是，在epsin敲除小鼠中观察到通过胆固醇-CD36的巨噬细胞通讯减少。
5. NeuronChat93是一个专门研究神经元之间通讯介导分子的工具，它还整合了囊泡运输蛋白和产生如神经递质这样的小化合物酶的额外信息。
6. 这个工具被用来识别小鼠大脑中前外侧运动皮层和初级视觉皮层的特定上下文CCI；在前外侧运动皮层，而不是在初级视觉皮层，将谷氨酸能细胞亚型L4/5 IT CTX推断为主要通讯节点，利用谷氨酸-Grin3a相互作用。
7. 尽管包括代谢物在内的策略产生了额外的生物学见解，但明显的重大局限性也是存在的。
8. 自然地，代谢物丰富度依赖于酶和运输蛋白的基因表达水平较少，而更多地依赖于代谢通量和其它调控模式，遵循比蛋白质更复杂的动力学。
9. 因此，需要进一步的工作，通过整合参与代谢物生产和分泌的其他过程来改进预测，以更好地表示它们的丰富度和活性。

para

1. 包括转录因子及其下游目标在内的细胞内信号传导途径也可以考虑，如SoptSC19和NicheNet20所述。
2. 例如，一些工具衡量CCI对接受细胞中的信号传导和转录调控的影响。
3. LRLoop99利用网络传播算法107与细胞内基因调控网络来优先考虑在两个细胞间形成细胞间反馈环的LRI。
4. 也就是说，它使用基因表达来寻找通过基因调控网络在细胞内连接的两个配体-受体对集合，形成一个闭合的环。
5. 这种多功能方法可以与其他现有工具进一步结合，以找到生物学上有意义的细胞间信号传导，从而帮助提高工具的真阳性率。
6. 其他工具直接使用转录因子和/或目标基因的基因表达来优先考虑特定的LRI。
7. 例如，Domino100关注受体的下游基因，以了解对植入生物材料的免疫反应。
8. 这个工具被用来识别通过Il4ra及其下游基因Esrra激活的抗炎巨噬细胞，以及通过Osmr及其下游转录因子Sox17内皮细胞激活的损伤修复信号。
9. 第三组工具使用下游基因来衡量分配给每个配体-受体对的通信分数。
10. CellComm105将这些权重纳入配体-受体到调节剂相互作用的网络中，并使用它们来最大化细胞间通信的信号流量，成本最低。
11. 另一个工具，exFINDER106进一步利用这些权重来研究数据中未直接呈现的细胞接收到的信号。
12. 因此，融入细胞内信号的工具可以更全面地代表与CCI相关的机制。

Broader: accounting for multiple conditions

更广泛的：考虑多种条件

para

1. CCIs 在其发生的生物背景下重度依赖32,33。
2. 生物背景，比如不同的遗传、细胞、细胞外或时间状态108，影响单个细胞和整个组织的 行为。
3. 这些背景在不同表型条件下变化，使得在单细胞图谱中研究CCIs变得困难，尤其是 它们有大量的样本。
4. 随着样本之间实验变量的增加，分析的复杂性呈指数增长109。
5. 这在CCI研究中尤其具有挑战性，因为研究者还希望考虑到所有细胞和LRIs组合的表型 关联。

para

1. 多种方法可以促进跨不同样本或条件下的CCI比较。
2. 然而，大多数工具仅限于进行简单的成对比较，通过在编码配体和受体的基因或CCI推理的最终得分上进行差异分析。
3. 例如，Connectome、CellChat、scDiffCom和scTenifoldXct依靠样本之间的成对比较来寻找差异CCI。
4. scTenifoldXct提供了进一步的不限于LRIs的CCI推理。
5. 通过利用两个样本的比较，这些工具可以揭示在一种条件下发生改变的具体LRIs和通讯途径。
6. 例如，比较年轻和老年小鼠的伤口愈合揭示了衰老通过生长因子、趋化因子和细胞因子途径影响CCI。
7. 特别是，老年皮肤伤口表现出通过BMP-2/4/7和TGFβ1/2/3通信的成纤维细胞信号传导失调。
8. 因此，这种失衡影响了成纤维细胞的增殖和伤口愈合。

para

1. 降维方法现在能够同时直接比较两个以上的样本（图3h）。
2. 诸如sciTD120、DIALOGUE121和MOFAcell122等工具使用基因表达值，通过分解方法推断多细胞程序（MCPs）。
3. 在这些情况下，得到的因子对应于每个MCP，并被分配给相关的样本。
4. 因此，可以通过使用MCPs来提取CCI的变化，其中配体和受体是决定因素。
5. 另一种方法，Tensor-cell2cell（参考文献33），直接对CCI分数进行张量分解132，该分数是在每个LRI组合、发送细胞和接收细胞的样本之间计算的。
6. 与MCPs不同，这个工具发现了CCI的上下文驱动程序，例如，可以与COVID-19严重程度33或神经发育阶段133相关。
7. TraSig127和TimeTalk128关注多个（伪）时间点之间的差异，同样识别CCI动态的变化，而不是基因表达动态的变化。
8. 与降维方法相比，MultiNicheNet129执行差异表达分析134，可以处理多个样本，使其能够解释批量效应和协变量。
9. 随着大多数单细胞和空间组学研究超越两个样本，这类方法将变得越来越重要。

Other features emerging in the evolution of tools

工具进化过程中出现的其他特征

para

1. 计算工具已经以超出前述类别的方式发展，使得改进范围从数据处理和可视化到构建高精度LRI数据库等各个方面。
2. 用户友好的交互界面是工具如InterCellar、Cellinker和TALKIEN等实现的一个关键方面。
3. 尽管大多数工具需要编程技能，但这些工具通过实施简单的图形用户界面来处理输入和部署可视化，从而简化了CCI分析中的每个步骤。

para

1. 一些工具正在涌现，它们用于对各种工具进行基准测试或利用。对于下一代工具而言，基准测试尤其重要；LIANA140 建立了一个平台，用于实施来自多个工具的方法，使得能够进行比较分析，结果表明各种方法之间重叠度低，这主要是由于优先考虑相关CCIs的不同方法造成的。
2. 为了帮助管理来自不同工具的输出异质性，LIANA 还包括不同选项之间的共识预测，提供更可靠的结果。
3. ESICCC151 是一个较为系统的工具基准测试框架，它提供了多个有价值的性能指标。
4. 此外，一些工具通过例如蒙特卡洛142和基于代理的模型150来模拟所有可能的CCIs宇宙，旨在找到显著结果，这些工具使得能够在计算机中实验探索‘如果’场景，而无需进一步的实验。

para

1. 其他方法使用数据驱动模型（框1）来评估多个LRIs的同时行为并推断CCI。
2. 例如，Calligraphy146使用通信基因共表达网络来识别信号基因模块。
3. 这种方法假定，与一次关注一个配体-受体对的方法相比，表现相似的细胞间基因群提供更强且噪声更小的信号。
4. 因此，Calligraphy成功识别了涉及IL-33的模块在上皮细胞和免疫细胞之间的共表达，这直接指向胰腺肿瘤发生146。
5. 一些方法还专注于构建高置信度LRIs列表147,148，这是CCI分析工作流程中的关键步骤，然后推断CCI。
6. 这些只是计算工具中出现的一些其他功能的几个例子，每种工具都旨在改善CCI预测的更具体方面。

Tracking cell–cell interactions

1. 在单细胞水平上验证细胞-细胞相互作用（CCIs）一直最易于通过专注于单一相互作用的实验研究来实现，例如荧光原位杂交、荧光共振能量转移和免疫染色。
2. 然而，利用这些方法来验证来自大规模单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究的CCI预测是困难的，因为它们仅限于在给定的实验中检查少数细胞和低分辨率相互作用（LRIs）。
3. 下一代实验方法正在出现，增加了CCI测量的通量。
4. 这些方法可以同时测量许多LRIs和细胞-细胞对（见表1），而且许多方法还将实验测定的相互作用与下游测序相结合。
5. 例如，这些方法已经帮助表征了大量的CCI网络，揭示了分子机制，并在体内追踪了CCIs。
6. 尽管这些技术已经详细审查过，但在这里，我们强调了与获得关于CCIs的生物洞察相关的例子，这些例子可能有助于改进上述计算工具并验证其预测，提高CCI推理的准确性。

Table 1 Illustrative next-generation methods for tracking cell–cell interactions (CCIs) 表1：追踪细胞-细胞相互作用（CCIs）的说明性下一代方法

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Profiling cell–cell interactions through sequencing technologies

通过测序技术分析细胞-细胞相互作用

1. 利用测序技术，已有几种实验工具促进了细胞-细胞接触的研究。
2. 核酸条形码可以被引入发送细胞，然后通过细胞-细胞相互作用（CCIs）转移到接收细胞（见图4a）。
3. 另外，基于液滴的方法可以隔离多个细胞，以捕获物理上相互作用的细胞（见图4b）。
4. 这两种方法在测序后都能以单细胞分辨率报告独特的发送者-接收者接触，这可以用来测试计算性的CCI预测。

Fig. 4: Major approaches in next-generation experimental methods for studying cell–cell interactions.

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• 测序技术不仅能够测量单细胞转录组，同时还能追踪在物理相互作用的细胞之间传递的条形码（例如通过转染或工程病毒传递的细胞）（a），或者通过生成多联体直接分离相互作用的细胞（例如使用荧光激活细胞分选或微流控技术）（b）。
• 因此，可以在推断这些细胞所使用的配体-受体相互作用（LRIs）的同时构建细胞-细胞接触网络。
• 细胞-细胞相互作用（CCIs）可以通过标记方法评估邻近细胞之间的相互作用，这些方法要么依赖于酶催化探针与受体结合来以接触依赖的方式标记LRIs（c），要么依赖于催化剂诱导可扩散标签的高度反应状态（其半径取决于其半衰期）以接触独立的方式标记LRIs（d）。
• 合成受体可以被设计成在每次与发送细胞产生的特定配体相互作用时，在接收细胞内诱导感兴趣的转录反应。
• 例如，发送细胞中的膜结合型绿色荧光蛋白（GFP）可以与由抗GFP（a-GFP）纳米体和Notch受体组成的合成受体一起使用。
• 这种合成受体可以帮助追踪发送者-接收者体内的相互作用。

para

1. 条形码技术在神经科学中具有无价的价值。例如，MAPseq161利用病毒粒子引入RNA条形码并追踪从源区域发出的单个神经元的投射。
2. BRICseq162和RABID-seq154都是基于这一概念，分别用于研究多个组织区域和单细胞分辨率下的细胞间通讯。
3. 通过考虑相互作用细胞的转录组，BRICseq有助于识别与大脑区域间的大脑连通性相关的基因162，而RABID-seq有助于发现Sema4D/PlexinB1、Sema4D/PlexinB2和Ephrin-B3/EphB3作为LRIs，规定在自身免疫中微胶质细胞与星形胶质细胞之间的病理相互作用。

para

1. 基于液滴的方法，如ProximID152和PIC-seq153，能够从转录组分析中实现高通量的CCI确定。这些方法并不使用条形码，而是利用物理相互作用的细胞在细胞分选过程中形成多细胞组合（如双细胞或三细胞组合）的事实。这些方法特别适合于探测测量时刻物理相互作用细胞之间的交互。此外，它们需要概率算法来解析一起测序的多种细胞类型的基因表达谱，随着每个多细胞组合中细胞类型的数量的增加，这可能更具挑战性。然而，它们的价值已经在各种应用中得到证明。例如，PIC-seq被用于识别特定CCI存在时富集的细胞交互和差异调节的基因，例如在肺发育过程中，早熟肺泡巨噬细胞与肺泡I型上皮细胞之间上调糖皮质激素应答基因。SPEAC-seq163,165通过将细胞对封装在油包水滴中，从而避开了细胞需要物理相互作用的要求。除了捕获额外的介质，如可溶性分泌配体外，这种方法还可以筛选发送细胞中的基因扰动，并量化接收细胞的响应。但是，它需要在封装之前对报告基因进行工程改造，这降低了通量，封装后的共培养可能无法反映体内条件。

Proximity labelling of cell–cell interactions

细胞-细胞相互作用的近端标记

para

1. CCIs可以使用依赖于酶或高活性化合物的接近度的化学修饰进行标记。
2. 这样的方法可以帮助研究人员研究相互作用细胞之间的细胞-细胞界面处的微环境和分子存在。
3. 这些技术可以分为接触依赖性或接触非依赖性标记方法。
4. 在这里，我们讨论了这两种方法，重点介绍了有助于检测细胞间关系并揭示CCIs重要方面的一些方法。

para

1. 在接触依赖性方法中，一种酶被定位到一个相互作用的细胞类型的细胞表面，并且这种酶催化探针与周围细胞表面上的受体的结合（图4c）。
2. 因此，这些方法显示出较小的半径，其中相互作用的细胞由于酶-受体相互作用的物理限制而被标记。
3. 例如，LIPSTIC155执行Sortase A（SrtA）介导的连接，以实现配体-受体对的体内标记。
4. 在这里，一个含有LPETG基序的肽底物通过SrtA转移到氨基末端的五甘氨酸（G5）受体上。
5. 因此，通过分别将SrtA和G5融合到LRI的一个成员上，这种方法被应用于研究小鼠免疫细胞突触。
6. 具体来说，通过聚焦CD40-CD40L的相互作用，LIPSTIC有助于显示T细胞最初以抗原特异性的方式与树突状细胞相互作用，但是一旦激活，它们就会以非特异性的方式相互作用。

para

1. 许多基于接触依赖的方法需要工程化特定的酶-受体对，因此其通量和可同时测试的细胞类型或细胞间相互作用的总量本质上受到限制。
2. 然而，像EXCELL156这样的新策略通过工程化SrtA来随意标记相互作用细胞的N端单甘氨酸，绕过了这一限制。
3. FucoID157是一种依赖於诱饵细胞膜上表达的岩藻糖基转移酶和添加生物素化底物来标记猎物细胞的方法，通过使用酶的化学酶法功能化而不是遗传工程，增加了通量。
4. 此外，这种方法可以区分强烈的细胞间接触与较弱的接触。
5. FucoID的一个扩展版本，使用基于抗体的探针，也使得在不从样品中纯化感兴趣细胞的情况下检测细胞间接触成为可能。
6. LIPSTIC的一个较新版本，即通用LIPSTIC(uLIPSTIC)169，通过放弃将SrtA和G5直接融合到相互作用的配体和受体上，克服了研究单个细胞间相互作用的局限性。
7. 相反，它将SrtA和G5融合到细胞膜上普遍表达的蛋白上。
8. 当功能相互作用期间相对膜距离接近（小于14纳米）时，添加生物素-LPETG底物促进SrtA介导的生物素标记G5，从而充当通用报告分子。
9. 通过伴随uLIPSTIC对关键标记物和/或细胞间相互作用的伙伴进行功能扰动，这种方法可以报告任何感兴趣的细胞间相互作用对整体细胞间接触的重要性。

para

1. 接触独立的方法依赖于高反应性化合物来标记CCI。
2. 在这些情况下，催化剂将小分子转化为高反应性状态后，它们会扩散并与邻近分子结合（图4d）。
3. 因此，它们的标记半径取决于其反应态的半衰期，这意味着可以使用不同的化合物来控制研究CCI的分辨率。
4. 多种方法使用工程化的抗坏血酸过氧化物酶（APEX）使化合物具有反应性。
5. TransitID利用两种正交的 promiscuous 临近标记酶，TurboID和APEX2，追踪蛋白质从源位置到目的地的运输，包括亚细胞运输和细胞间相互作用。
6. 特别是，TransitID在多个时间点和纳米级空间分辨率捕获全蛋白质组的相互作用。
7. 此外，它还能识别超越直接细胞接触的CCI，区分可溶性蛋白质配体与细胞膜受体的结合以及外泌体和纳米管向接收细胞细胞内隔室的运输。
8. 然而，如果没有多个正交的临近标记酶，它一次不能探测超过两种细胞类型。
9. 此外，基于APEX方法的一个主要局限是它们依赖于有毒的过氧化氢，因此限制了进行CCI研究的实验条件。

para

1. 其他非接触依赖性方法已经克服了使用有毒化合物的难题。BioID174、TurboID167和split-TurboID172,175使用了与感兴趣蛋白融合的 promiscuous 生物素连接酶。
2. 这些工程蛋白可以腺苷酸生物素，随后生物素会扩散并标记其他邻近蛋白，从而使得研究LRIs成为可能。
3. 光催化标记方法也避免了有毒化合物的使用。
4. 例如PhoTag158和μMap166使用光来控制化合物的高度反应状态，从而控制其标记范围。
5. 与FucoID相似，它们也有助于绕过基因工程的需要。
6. 在这方面，PhoTag已经被应用于研究外周单核血液细胞和Raji PD-L1 B细胞之间的CCIs。
7. 研究发现T细胞亚群与Raji细胞通过PD-1/PD-L1的短暂相互作用存在差异，这有助于区分T细胞亚群之间的不同响应模式。
8. 然而，PhoTag仅针对单一LRI。
9. 在μMap的情况下，这项技术捕获了配体与其所有局部受体的极其高分辨率（1 nm）的相互作用。
10. 这种分辨率非常有用，能够区分同一细胞上空间不同的质膜受体，尽管它不能确定给定配体的发送细胞。

Synthetic circuits for tracking cell–cell interactions and intracellular activities

用于追踪细胞-细胞相互作用和细胞内活动的合成电路

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1. 合成受体和通路传感器可以揭示细胞-细胞相互作用（CCIs），并量化特定淋巴细胞受体（LRI）对接受细胞的影响。
2. 合成受体允许定制细胞如何感知并响应不同的信号（见图4e）。
3. 这些系统可以被设计来报告在结合膜结合配体后的细胞间接触，揭示在结合可溶性配体后的细胞微环境中的线索，以及通过结合细胞内空间的配体来阐明细胞内因子的存在。
4. 例如SynNotch等合成受体使得标记直接细胞-细胞接触成为可能，以评估诸如胚胎发育等时间过程。
5. 例如，它帮助显示与心肌细胞相互作用的内皮接受细胞从心脏迁移到肝脏以形成血管，当与肿瘤相互作用时，它们激活血管生成、迁移和炎症反应。
6. SynNotch还适配到SyNPL系统中，用于研究哺乳动物发育中的CCIs，该系统在体外和体内跟踪并操纵发送者-接受者相互作用。

para

1. LRI触发的下游细胞内活动，如信号传导，可以通过细胞内感兴趣途径中的合成电路来研究。
2. 这些电路通常依赖于携带途径报告基因的基因构建体。
3. 例如，通过将不同的途径启动子与萤光素酶结合，已经鉴定出21种不同的SARS-CoV-2蛋白质在调节10个信号传导途径中的作用。
4. 尽管在这个案例中，效果是在过表达这些蛋白质的细胞上评估的，但这种方法有潜力评估来自其他细胞的信号的影响。
5. 在另一个例子中，通过体外多路复用分析检测小分子气味配体与嗅觉受体的结合效应，这是最大的G蛋白偶联受体(GPCRs)家族，鉴定出数十种新的相互作用。
6. 重要的是，这些新相互作用揭示了对15个受体未知的配体。
7. 这种方法被称为中等通量，因为它涉及工程条形码报告基因，但可以扩展到96孔板。
8. 其他之前提到的技术也可以与这种方法结合，以达到更高的通量。

Challenges and opportunities

1. 上述创新为单细胞水平上具有更高通量和深度的文化创意产业（CCIs）带来了新的启示。尽管计算和实验方法使新的生物学问题得以解答，但仍然存在各种挑战和创新的机会（见图5）。

Fig. 5: Challenges and opportunities for enhancing methods for cell–cell interaction research.

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• 在不同条件下对单个细胞进行比对是困难的，因为每个样本在细胞数量上固有差异，这挑战了在单细胞分辨率下跨条件进行细胞-细胞交互（CCI）比较。如果没有校正，这种情况将导致鸽巢原理（即，不是所有细胞都能从一个条件一对一地比对到另一个条件）。
• 配体-受体相互作用（LRIs）的组合，考虑到它们不同的蛋白质变体，也塑造了下游基因的表达，导致相似的CCI产生不同的转录响应。将这一信息融入CCI研究，可能会提高预测并捕捉到信号活动的新生物学见解。
• 多年来，生成基准数据一直是一个主要挑战；然而，为了解决这一问题，正在开发真实的交互作用整理数据库，这有助于校准和调整计算工具。此外，社区组织的努力将是用下一代实验方法生成金标准数据的关键。
• 包括配体和受体的亚细胞定位可以优化相互作用的细胞预测。
• 大多数实验方法仅限于原位和体外部署，体内研究工作较少。随着允许同时评估许多LRIs和用于追踪相互作用的工程化配体和受体库的实验方法的进步，将获得进一步的发展。

para

1. 重大发现依赖于增加CCI研究的规模，通过引入新方法，这些方法要么以单细胞分辨率推断CCI，要么允许同时分析来自不同条件的多个样本中的CCI。
2. 因此，未来的工作可以通过同时包括这两种情况来进一步改进CCI工具；然而，这需要跨条件对单细胞进行对齐。
3. 不幸的是，样本中不含有相同数量的细胞，这阻碍了在一个检测中匹配细胞与另一个检测中的细胞（图5a）。
4. 因此，样本中细胞数量的差异可能与某些算法不兼容，这意味着可能需要包括数据插补，特别是在单细胞分辨率上。
5. 例如，DURIAN184在单细胞数据中插补基因表达，并将批量数据解卷积到单细胞水平，有望促进CCI的单细胞分辨率跨条件比较。
6. 此外，推断CCI的全面框架的发展，如CellChat（V2）185、CellPhoneDB（V5）186和LIANA+187的最新版本，可能有助于这项任务，因为它们旨在包括各种策略和功能，涵盖工具多样化的绝大多数方面（图1a）。
7. 例如，LIANA+是一个一体机工具，甚至由多个其他工具提供支持，能够整合多模态数据，基于非蛋白质配体推断CCI，检测CCI模式，检查细胞内变化，以及使用假设自由和假设驱动方法评估多种条件。

para

1. 构建LRI数据库对于研究CCIs至关重要。这一步骤涉及诸如关注高置信度的LRIs等基本方面，包括蛋白质亚基、激活剂、抑制剂和/或竞争者，以考虑LRIs的信号传导活性，并整合基因调控网络以捕捉细胞内过程。在这方面，AlphaFold已显示出揭示未识别LRIs的巨大潜力。然而，构建在生物学上全面的数据库仍需解决，这限制了工具推断CCIs的性能。特定的配体和其相应的受体的组合可以在不同的细胞类型中触发不同的信号传导活性。特别是，不同的配体变体可以与不同的受体变体进行多态性交互。这导致了一种多对多的关系，其中每个配体变体以不同的强度与多个受体变体结合，反之亦然。这意味着配体和受体与它们的伴侣竞争相互作用，并且这种竞争取决于遗传背景。因此，接收细胞 的信号传导过程将取决于其受体的特定表达谱。因此，包含配体和受体变体、它们的相互作用亲和力和表达谱的新数据库和算法可能有助于更好地捕捉细胞内事件的激活方式，从而提高CCI预测的稳健性。

para

1. CCI工具也因有限的真实数据而具有较高的假阳性率，这对于评估和改进这些工具性能的基准分析至关重要（图5c）。
2. 特别是当大量推断的CCI图集开始出现时，这一点尤为关键。
3. 因此，生成金标准数据集对于通过适当的指标（如准确度、精确度、召回率、F分数和均方根误差）评估工具性能至关重要。
4. 构建此类参考数据通常涉及从文献中手动整理CCI，包括多种细胞类型和分子介质，例如CITEdb193和Cellinker136。
5. 其他情况是针对特定细胞或组织的数据集进行整理的CCI，例如肿瘤-免疫细胞通讯数据库188和特发性肺纤维化数据库194。
6. 然而，多种工具的存在导致了众多基准场景，使得对工具性能进行全面评估变得具有挑战性。
7. 尽管如此，一些研究已经尝试评估工具捕获短距离CCI的能力87，测量它们的健壮性和一致性140,149，并评估工具在特定基准场景中的表现151,194或按表型对样本进行分类的能力33,187。
8. 此外，创建如scMultiSim144等框架对于提供模拟不同单细胞行为模态的硅基真实数据非常重要，包括基因调控网络推断、RNA速度估计、批次效应、空间组织和CCI。
9. 然而，这些方法中没有一种能够完全涵盖CCI的所有不同方面，从而全面帮助改进计算工具的性能。
10. 因此，进一步的研究需要通过应用例如此处描述的实验方法（参见"追踪细胞-细胞交互"）来扩展包含真实交互的资源。
11. 这可以作为在多个基准场景下社区组织生成金标准数据的更大基础，正如之前为构建促进免疫细胞交互的表面蛋白资源所实现的那样。

para

1. 实验方法使得分析细胞-细胞接口处的蛋白质组织成为可能。
2. 然而，当前的计算工具对于配体和受体的膜亚定位（图5d）提供了有限的洞察。
3. 可以考虑开发新算法来研究免疫突触和胚胎发育动力学的膜蛋白相互作用的生物物理特征（如定位、强度和细胞骨架耦合）。
4. 例如，通过使用抗原亲本蛋白的亚细胞位置，改进了对免疫疗法反应的预测，这表明分子媒介的亚细胞位置可能对CCI推断具有信息价值。

para

1. 最近的实验方法提高了测量细胞-细胞相互作用（CCIs）的通量和准确性。
2. 然而，许多挑战仍然存在，例如在测量主要是直接细胞接触方面的限制；同时测量许多局域化细胞间相互作用（LRIs）和细胞对方面的困难；以及与现场测量相互作用相关的问题（图5e）。
3. 这些限制和实验方法所需的专门知识（表1）进一步扩大了在验证计算工具输出方面的努力所存在的差距。
4. 因此，很少有实验方法与计算工具相结合使用153,154。
5. 然而，这里讨论的许多方法可以与下游RNA测序相结合，然后用于约束CCIs的计算推断。
6. 我们预计将出现额外的技术，报告更多经过验证的CCIs，并将它们与下游测序和计算分析相结合。
7. 例如，uLIPSTIC可以与单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合，揭示复杂的CCIs169。
8. 此外，将这些方法与正交方法相结合，评估分子和细胞的共定位将有助于识别更多的CCIs，并处理测量相互作用的障碍（例如，在缺少此类信息的方法中识别源细胞）。
9. 例如，为了帮助扩大实验获得的CCI和LRI网络规模，实验方法可以与多路复用蛋白成像方法198如CODEX199结合使用，该方法利用与DNA条形码结合的抗体在组织内空间可视化多个蛋白标记。
10. 此外，新兴的标记分泌信号200,201和长距离通信机制202的方法将是跟踪CCIs时使这些高通量实验方法更加全面的关键。
11. 进一步的创新将继续解决上述局限性，这种进步对于计算推断将是必不可少的，通过以特定上下文的方式直接测量许多CCIs，为训练和验证提供极好的资源。

Conclusions

1. 近年来，用于研究细胞-细胞相互作用的工具已经经历了显著的多样化。
2. 计算工具已经从基于核心基因表达的方法发展到下一代策略，这些策略整合了细胞的额外生物学特性。
3. 同样，更先进的实验方法增加了通量能力，允许同时分析多个通讯途径；因此，为细胞-细胞相互作用提供了更全面和生物学上有意义的见解。
4. 计算和实验方法都表现出极大的互补性和协同性，这可以扩大它们在生物医药和个性化医疗等领域有影响力的应用的潜力。
5. 因此，应对这些新的机遇将是深化我们对细胞-细胞相互作用的理解的核心。