特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种常见的炎症性皮肤疾病，特征为剧烈瘙痒、复发性湿疹样病变和Th2介导的免疫反应。调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg）在调控炎症、抑制Th2细胞(T helper 2 cell)和维持免疫稳态中发挥关键作用。先前的研究对于AD患者中Treg比例存在冲突结果，一些研究发现Treg比例未改变，而其他研究则报告Treg数量增加。在过敏性疾病中，Treg对Th2细胞的抑制作用被破坏以及Th2型炎症的促进背后的精确分子机制尚不清楚。因此，探究AD中Treg数量和功能变化背后的分子机制至关重要。

近日，南方医科大学皮肤病医院梁云生课题组探讨了在特应性皮炎（AD）中，Treg数量和功能变化的分子机制，以及这些变化如何影响Th2型炎症。相关研究成果以“IL-4-induced decrease in boththe number and CTLA-4 expression of Tregimpairs suppression ofTh2 type inflammation in severe atopic dermatitis”为题发表在《Journal of Dermatological Science》期刊。

研究通过流式细胞术、mRNA测序（mRNA-seq）、共培养实验、共免疫沉淀、染色质免疫沉淀和亚硫酸盐测序（BS-seq）等方法，在体外或AD小鼠模型以及AD患者中研究分子机制。分析结果表明在轻度和中度AD中检测到Treg比例增加。而在重度AD患者中，Treg数量和CTLA-4表达特征性减少则与血清IL-4 (interleukin-4)水平相关，这与体外高浓度IL-4处理下的验证分析结果一致。其背后机制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2来抑制Foxp3和CTLA-4位点的转录调控。高水平的IL-4破坏了Treg通过CTLA-4介导的Th2细胞分化抑制，而在Treg中阻断IL-4Rα信号恢复了AD模型小鼠和AD患者的Treg数量和Th2细胞抑制。

总之，本研究结果表明，Treg数量及AD患者严重程度分级与血清IL-4水平相关。异常高水平IL-4表观遗传调控Treg数量和CTLA-4表达减少。IL-4诱导Treg上的CTLA-4表达减少损害了Th2细胞分化抑制。

研究方法

研究队列：42名AD患者和14名健康志愿者（(healthy volunteers，HVs），以及用于实验的特定基因敲除小鼠。

通过MC903诱导AD小鼠模型，评估耳厚度和组织学变化。

从人和小鼠样本中分离和分化细胞，进行Treg抑制实验和流式细胞术分析。

使用ELISA和Western blotting技术分析血清和蛋白表达水平。

通过亚硫酸盐测序（Target-BS）和共免疫沉淀实验分析DNA甲基化和蛋白相互作用。

进行染色质免疫沉淀（ChIP）和RT-qPCR分析特定基因位点的表观遗传修饰。

结果图形

（1）Treg数量与AD严重程度分级和血清中IL-4水平相关。IL-4导致重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达减少。

图1. IL-4水平增加导致重度AD患者中Treg数量和CTLA-4表达减少。A.AD患者和健康志愿者（HVs）中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD3+ CD4+ T细胞中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。B.AD患者和HVs的血清IL-4水平。C.重度AD患者和年龄性别匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+表达（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。D.AD患者中Foxp3+、CTLA-4+表达与血清IL-4水平之间的相关性。E.培养的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T细胞中筛选）、CTLA-4+表达（在CD4+ T细胞中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。

（2）IL-4/pSTAT6信号通路如何通过招募DNA甲基转移酶1（DNMT1）和组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）来抑制Foxp3和CTLA-4基因位点的转录调控。

图2. IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2来抑制Foxp3和CTLA-4位点的转录调控。从健康志愿者（HV）的外周血单个核细胞（PBMCs）中纯化出初始T细胞，并在体外用IL-2/TGFβ1培养4天，然后有或没有高浓度IL-4刺激额外3天。 A. 聚类热图显示培养的Treg中转录因子差异表达，其中深红色表示高基因表达水平。 B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs蛋白。 C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位点的CpG DNA甲基化，以分析IL-4处理/未处理组Treg的甲基化状态。图表显示通过亚硫酸盐测序鉴定的DNA甲基化数量。 D. 收集Treg细胞、裂解，并用抗pSTAT6抗体免疫沉淀（IP）。通过免疫印迹法分析IP蛋白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗体。 E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗体进行ChIP实验。通过实时PCR检测Foxp3启动子和CNS2的免疫沉淀DNA的相对量，并相对于IgG进行归一化。 F. Treg被转染HDAC2 siRNA或对照siRNA，并在体外用IL-2/TGFβ1培养4天，然后有或没有高浓度IL-4刺激额外3天。代表性的流式细胞术和定量分析Foxp3+和CTLA-4+表达。 G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗体进行ChIP实验。通过实时PCR检测Foxp3和CTLA-4启动子的免疫沉淀DNA的相对量，并相对于IgG进行归一化。每组n=3，三个重复。  

（3）高水平IL-4破坏了CTLA-4介导的Treg对Th2细胞分化的抑制作用。

图3. 高水平IL-4破坏了CTLA-4介导的Treg对Th2细胞分化的抑制作用，OTII小鼠脾脏中分离的CTV标记的CD4+ CD25− Teffs和从BMDCs衍生的DCs与Foxp3YFP/Cre或Il4rafl/fl Tregs以1:1:1的比例共培养2天。 A. CTV标记的Teffs数量和定量。 B. Teffs中IL-4表达的代表性流式细胞术和定量分析。每组n=3，三个重复。

（4）IL-4在AD小鼠模型中破坏了Treg对Th2型炎症的抑制作用。

图4. IL-4破坏了AD小鼠模型中Treg对Th2型炎症的抑制作用。 A. 第16天用乙醇（EtOH）或MC903处理的小鼠耳朵的代表性图像和组织学H&E染色结果。 B-C.  第16天从整个耳朵和血液中IL-4+表达的代表性流式细胞术和定量分析。 D-E.  第16天从整个耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+表达的代表性流式细胞术和定量分析。每组n=3只小鼠，三个重复。

（5）达必妥(Dupilumab) 恢复了重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达，并抑制Th2型炎症。

图5. Dupilumab恢复了重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达及其对Th2炎症的抑制作用。 A. 在不同时间点对AD患者外周血中Foxp3+ CD25+ Treg的代表性流式细胞术和定量分析。 B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式细胞术和定量分析。 C. 在不同时间点对Th2细胞的代表性流式细胞术和定量分析。

易小结

Treg数量和AD的严重程度分级与血清IL-4水平相关。

异常高水平的IL-4表观遗传调控Treg数量和CTLA-4表达减少。

Treg中由IL-4诱导的CTLA-4表达减少破坏了Th2细胞分化抑制。

阻断Treg中的IL-4Rα信号可以恢复Treg数量和对Th2型炎症的抑制，为AD治疗提供了新的策略和深入的机制理论。

参考文献：

WangB, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, XuY, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopicdermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi:10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.