背景
我们在进行高通量测序后，会对筛选得到的差异基因进行qpcr验证。而在很多器官中，因为基因的特异性表达，有些外显子存在组织特异性。这就会导致qpcr的结果可能与高通量得到的结论不同。为了将qpcr与高通量的结果更好地结合，我们可以考虑将高通量结果中qpcr靶向的序列进行定量，这样可以更好地与qpcr的结果交互验证。
思路
1、使用blast确定primer比对到的序列，并获得靶序列在基因组/转录组上的区间（参考链接、参考链接)）
2、使用samtools view根据上一步获得的区间，将高通量数据中的靶序列的比对情况提取出来
3、使用featurecount对这部分bam文件进行重新定量
方法
1. 安装blast
#构建conda环境
conda create -n blast
conda activate blast
#安装
conda install blast
2. 构建数据库
#查看帮助文档
blastn -help
makeblastdb -help
#构建比对库:小鼠的库构建得很快
nohup makeblastdb -in ~/my_genome_reference/mouse/mm10/Mus_musculus.GRCm38.dna.primary_assembly.fa -dbtype nucl -parse_seqids -out mouse_mm10 &
3. blast
test.fasta的内容
>Trp53_primer1
CTCTCCCCCGCAAAAGAAAAA
>Trp53_primer2
CGGAACATCTCGAAGCGTTTA
>P21_primer1
CCTGGTGATGTCCGACCTG
>P21_primer2
CCATGAGCGCATCGCAATC
>MLKL_primer1
AATTGTACTCTGGGAAATTGCCA
>MLKL_primer2
TCTCCAAGATTCCGTCCACAG
>Cdkn2a_primer1
CGCAGGTTCTTGGTCACTGT
>cdkn2a_primer2
TGTTCACGAAAGCCAGAGCG
>telomerase_primer1
CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT
>telomerase_primer2
GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT
>36B4_primer1
ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG
>36B4_primer2
TCAATGGTGCCTCTGGAGATT
>Sod1_primer1
AACCAGTTGTGTTGTCAGGAC
>Sod1_primer2
CCACCATGTTTCTTAGAGTGAGG
>Sod2_primer1
CAGACCTGCCTTACGACTATGG
>Sod2_primer2
CTCGGTGGCGTTGAGATTGTT
比对：
#比对
blastn -task blastn -query test.fasta -out test.output -db mouse_mm10 -outfmt 7 -num_threads 4 -evalue 100
-max_target_seqs 2
#注意！！evalue是用来衡量比对显著性的值，越小越显著，但是我们用的是基因组做的库，比对的primer可能是转录组，因此可能会有gap，所以为了尽可能有hit，可以将它挑的大一点，我们最后根据匹配的碱基数目去鉴定特异性
#task 选择blastn，默认为megablast，只能找到相似度90%以上的序列！
#max_target_seqs 用于调节最多匹配的核酸序列数目
#当然，最好使用RNA库在做一遍
注意：这里得-outfmt可以用特定的格式展示输出
-outfmt <String>
alignment view options:
0 = pairwise, #显示配对情况
1 = query-anchored showing identities,
2 = query-anchored no identities,
3 = flat query-anchored, show identities,
4 = flat query-anchored, no identities,
5 = XML Blast output,
6 = tabular,
7 = tabular with comment lines, #带有列名注释
8 = Text ASN.1,
9 = Binary ASN.1
10 = Comma-separated values
4. 整理比对结果
library(stringr)
library(dplyr)
library(plyr)
x<-read.table("test.output")
#这里的SOD1和MLKL的匹配序列太离谱了，我们先删除，之后手动检查后做
x<-x%>%ddply(.,.(V1),function(x){x%>%arrange(V11)%>%.[1,]})
x$gene=str_split(x$V1,"_",simplify = T)[,1]
x<-x%>%filter(!gene%in%c("MLKL","Sod1"))
x<-x%>%ddply(.,.(gene),function(x){start=x$V9;end=x$V10;start=min(c(start,end));end=max(c(start,end));data.frame(chr=x$V2,start=start,end=end)})
x<-x[!duplicated(x$gene),]
x<-data.frame(position=paste(x$chr,":",x$start,"-",x$end,sep = ""))
write.table(x,"product_position.txt",row.names = F,col.names = F,quote = F)
#配合samtools view的参数格式，可以直接这样打印出来
paste(x$position,collapse = " ")
#5:115561162-115561218 4:89294391-89294498 17:29098417-29098501 17:13008246-13008338 11:69589811-69590667
5. 将所有的bam文件提取子集并在该区间内定量
-
使用samtools提取子集
mkdir qpcr_quantity&&cd qpcr_quantity #确定所有的bam文件的位置 find ../ -name *bam >bamfile.list #提取子集 samtools view -h bamfile 染色体：start-end cat bamfile.list |while read id;do samtools view -h $id 5:115561162-115561218 4:89294391-89294498 17:29098417-29098501 17:13008246-13008338 11:69589811-69590667 >${id}.sub;done mv `find ../ -name *sub ` ./ 使用featurecounts定量
featureCounts -T 10 -a ~/my_genome_reference/mouse/mm10/Mus_musculus.GRCm38.99.gtf -o read.count -p -B -C -t exon -g gene_name *bam.sub
6. 使用R对readcount做简单统计
x<-read.table("../qpcr_quantity/read.count",header = T)
colnames(x)
all_rowsums<-x[,-c(1:6)]%>%rowSums()
x<-x[all_rowsums!=0,]
x<-x[,-c(2:6)]
x
因为做q的时候都要做内参的，这里在标准化的时候，可以以内参的count数为1，然后其它基因与内参作比较（类似于q的标准化方法）
7. 小结
该方法的缺点：最佳匹配不一定是目标序列
1、由于我使用的是基因组构建的比对库，其中不包含转录本的可变剪切信息，因此会导致某些引物比对质量很差，如该案例中#补充，MLKL的reverse primer只有13bp能比对上，后来通过igv发现，其1-13在exon9上，其余的序列分布在别的exon上，这样比对的结果是非常差的，因此后续要尝试用转录组建库
2、这种比对是把primer分别比对的，与primer blast还是有差别的，因此需要人工校验比对的结果，比如primer1在2号染色体上，primer2可能在2号和4号染色体上均有最佳比对。
3、这里提供两个下来refseq数据库的方法：从RefSeq数据库批量下载微生物基因组 - 知乎 (zhihu.com)、下载refseq序列_马志远的生信笔记的博客-CSDN博客
4、登录到NCBI的FTP的方式：如何下载NCBI refseq？ - 简书 (jianshu.com)
#人的下载方式
#鼠的下载方式
分割符
基于转录本的定量方法
背景
如上所述，我们是基于基因组进行qpcr靶序列的定量，但是这种方法有时候并不准确，因此我们需要从转录本水平进行数据重比对，然后定量，方法与基于基因组的方法基本吻合
实现方法
1、下载转录本数据
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/annotation_releases/10090/109/GCF_000001635.27_GRCm39/GCF_000001635.27_GRCm39_rna.fna.gz
2、构建索引及比对
#注意这里使用的转录本数据，按理讲应该使用基于基因组的比对方法（因为hisat会考虑可变剪切，转录本水平不应该考虑这个。）但是为了方便，还是用hisat2哈！
#构建索引
hisat2-build -p 10 ../GCF_000001635.27_GRCm39_rna.fna refseq_grcm39
#比对
hisat2 -p $threads1 --dta -x $index_file -1 $fq1 -2 $fq2 | samtools sort -@ $threads2 -o qpcr_quantity/$id.sorted.bam -
#构建index
samtools index -@ $threads $bam
3、对qpcr引物进行blast，确定在转录本 上的位置（参考上文2，3，4步）
这里注意：在使用refseq库的时候，blast会默认把region的版本号去掉，如XM_030245923.2会变成XM_030245923,所以要与bam的header比较一下
4、从比对好的bam中把靶序列区域的比对情况提取出来（参考上文第5步（1））
5、基于第3步的结果，手动做一个靶区域的gtf，用于featurecounts（搜了很多，没有办法从fasta直接变成gtf）
#示例文件
# chr gene start end region
# 1 NM_007475 36B4 503 559 NM_007475.5
# 2 NM_007669 P21 114 198 NM_007669.5
# 3 NM_009877 Cdkn2a 103 210 NM_009877.2
# 4 NM_011434 Sod1 179 295 NM_011434.2
# 5 NM_013671 Sod2 293 385 NM_013671.3
# 6 XM_030243820 MLKL 1267 1443 XM_030243820.2
# 7 XM_030245923 Trp53 1466 1529 XM_030245923.2
my_gtf<-data.frame(seqid=x$region,
source=".",
feature="exon",
start=x$start,
end=x$end,
score=".",
strand=".",
phase=".",
attributes=paste("gene_name"," ",'"',x$gene,'"',sep = ""))
#注意，一定是改成tab分割，不然计数的时候会报错
write.table(my_gtf,"../qpcr_quantity/my_gtf_qpcr_quantity.gtf",row.names = F,col.names = F,quote = F,sep = "\t")
6、featurecount定量
featureCounts -T 10 -a my_gtf_qpcr_quantity.gtf -o read.count -p -B -C -t exon -g gene_name -f -F GTF *bam.sub
7、查看定量的结果，并读入R做统计即可！
https://mytuchuangwhq2.oss-cn-qingdao.aliyuncs.com/image-20220422113235245.png
