三代数据由于其高错误率(目前应该是10%左右), 即便在组装前有一步纠错环节，但是组装得到序列依旧存在着许多错误，因此需要进行polish环节。polish分为两个层次，三代原始序列polish和二代序列polish。其中三代纠错这一步速度会很慢，所以有些人会选择直接用二代序列进行纠错。（从我个人项目经验来看，直接用二代纠错的效果和先三代再二代区别并没有那么显著，也有可能是我的项目经验太少）。
Pacbio专门开发了一套工具用于对初步组装的结果进行polish，减少基因组中的错误碱基，而nanopore组装结果一般会用minimap+racon。Pacbio目前有两个平台，RSII和Sequal，以及不断更新的测序试剂。目前最新的是sequal平台，本文针对的是sequal平台的组装结果。
安装篇
推荐用conda安装pacbio公司的工具全家桶，方便而且不容易出各种诡异的问题， 同时建议采用我的代码，专门为pacbio的工具集建一个环境
#安装
conda create -n pb-assembly pb-assembly
# 启动
conda activate pb-assembly
使用篇
主要分为两个步骤，比对和polish。 比对这一步用的是blasr，是目前三代比对软件中速度最慢，但是效果最好的工具，polish这一步分为两种情况考虑，对于RSII需要用quiver, 对于Sequal则是Arrow。
假设你目前已经准备好了两类数据：
- raw_assembly.fa, Falcon, Canu或者其他软件组装得到结果
- input.info，里面每一行类似于xxx.subreads.bam, 是公司提供的subread数据。
我写的运行脚本如下， 使用方法为"bash arrow_polish.sh raw_assembly.fa input.fofn`
#!/bin/bash
set -e
set -o pipefail
set -u
REF=$1
BAM=$2
THREADS=100
source activate pb-assembly
if [ ! -f $REF.fai ]; then
samtools faidx $REF
fi
if [ ! f aln.bam ];then
pbalign \
--tmpDir=./ --nproc=${THREADS} \
--minAccuracy=0.75 --minLength=50 \
--minAnchorSize=12 --maxDivergence=30 --concordant --algorithm=blasr \
--algorithmOptions=--useQuality --maxHits=1 --hitPolicy=random --seed=1 \
$BAM ${REF} aln.bam
fi
variantCaller --algorithm=arrow \
-x 5 -X 120 -q 20 -j 24 \
-r $REF aln.bam \
-o cns.fasta -o cns.fastq || echo quvier failed
通常这一步要迭代2~3次，第一次效果最好，后续依次递减。从BUSCO值看的话，Falcon组装结果polish后会比Canu有明显的提升，这主要是因为Canu的纠错一步效果好于Falcon.
后续的二代polish，请阅读使用Pilon对基因组进行polish
注意事项
pbalign是一个流程工具，会用blasr比对，然后用samtools sort进行排序。排序时默认设置每个线程为4G, 所以在排序阶段用到的内存总量为 nproc x 4. 如果你的线程数设置很高，但是内存不怎么够的话，请修改/path/to/pb-assembly/lib/python2.7/site-packages/pbalign/bampostservice.py的里如下内容(/path/to 是你自己服务器上pb-assembly前面的文件路径)
如果程序在这步中断，可以复制报错信息中的代码，修改内存后运行，结束后用
pbindex建立索引，最后重新运行脚本即可。
