CRISPR筛选原理

CRISPR筛选是一种高通量的功能基因组学技术，利用CRISPR-Cas系统系统性地扰动基因组中的基因，以鉴定它们在特定生物过程或表型中的作用。它基于CRISPR-Cas系统精确编辑DNA的能力，该系统最初源自细菌的免疫系统。以下是其原理的详细分解：

1. CRISPR-Cas的核心机制

CRISPR（成簇规律间隔的短回文重复序列）筛选依赖于Cas酶（通常来自链球菌的Cas9）和引导RNA（gRNA）来靶向特定的DNA序列。其关键步骤包括：

gRNA设计：gRNA是一种短RNA分子，包含两个部分：
- 一个20个核苷酸的序列（spacer），与目标DNA互补配对。
- 一个骨架序列，与Cas酶结合。
  gRNA通过与目标DNA的碱基配对，将Cas酶引导至特定的基因组位点，前提是存在一个邻近原型间隔序列基序（PAM），例如Cas9需要的NGG序列。
DNA切割：一旦结合，Cas9在目标位点（通常在PAM上游3–4个核苷酸处）引入双链断裂（DSB）。
DNA修复：细胞通过以下方式修复DSB：
- 非同源末端连接（NHEJ）：一种易出错的修复过程，常引入小的插入或删除（indels），导致基因敲除，破坏编码序列。
- 同源定向修复（HDR）：在筛选实验中较少使用，但在提供供体DNA模板时用于精确编辑。

在CRISPR筛选中，NHEJ诱导的基因敲除最为常见，因为它能破坏基因功能，允许研究者研究功能丧失的效应。

2. CRISPR筛选的类型

CRISPR筛选可根据研究目的进行调整，主要包括以下类型：

CRISPR敲除（CRISPR-KO）：标准方法，gRNA靶向蛋白编码区域，产生功能丧失突变，用于鉴定关键基因或与特定表型（如药物抗性）相关的基因。
CRISPR干扰（CRISPRi）：使用催化失活的Cas9（dCas9）与转录抑制因子融合，抑制基因表达而不改变DNA序列。这种方法是可逆的，适用于研究敲除会导致细胞死亡的必需基因。
CRISPR激活（CRISPRa）：dCas9与转录激活因子融合，上调基因表达，用于功能获得研究。
碱基编辑筛选：较新的系统使用碱基编辑器（如胞嘧啶或腺嘌呤碱基编辑器）引入单核苷酸变化，允许在不引入DSB的情况下进行精确突变研究。

每种方法以不同方式修改基因功能，灵活地探究基因的作用。

3. gRNA丰度变化的原理

在CRISPR筛选（特别是池式筛选）中，gRNA（引导RNA）被用来靶向特定基因，引起基因功能扰动（通常是敲除）。通过比较筛选前后细胞群体中gRNA的丰度变化（即gRNA的相对数量），研究者可以推断哪些基因对特定表型（如细胞存活、药物抗性）有重要影响。gRNA丰度的变化分为富集和耗竭两种情况，分别反映了基因功能丧失对细胞选择性影响的不同结果。

以下是详细原理：

3.1 CRISPR筛选的基本流程回顾

为了理解gRNA丰度的变化，先简要回顾池式CRISPR筛选的工作原理：

初始状态：一个包含数千到数百万个gRNA的文库被导入细胞群，每个gRNA靶向一个特定基因。低感染复数（MOI）确保每个细胞通常只接收一个gRNA，从而将细胞的表型与其靶向基因关联。
选择压力：细胞群接受某种选择压力（如药物处理、特定生长条件），导致某些细胞存活或增殖，而其他细胞死亡或增殖受限。
gRNA丰度测量：通过下一代测序（NGS）技术，在筛选前后提取细胞的基因组DNA，扩增并量化gRNA的丰度。丰度变化反映了特定gRNA（及其靶向基因）对细胞表型的影响。

富集和耗竭是基于筛选后gRNA相对丰度的变化来定义的：

富集：某些gRNA在筛选后变得更常见（丰度增加）。
耗竭：某些gRNA在筛选后变得更少见或消失（丰度减少）。

3.2 富集gRNA的原理

富集指的是在筛选后，某些gRNA的相对丰度显著高于初始状态。这表明敲除这些gRNA靶向的基因赋予了细胞某种选择优势，使这些细胞在选择压力下更有可能存活或增殖。

机制：

选择优势：当某个基因被敲除后，细胞在特定选择压力下获得生存或增殖优势。例如，在药物抗性筛选中，敲除某些基因可能使细胞对药物不敏感，从而在药物处理后存活下来。
细胞富集：携带这些gRNA的细胞在选择压力下存活并增殖，而其他细胞死亡或增殖受限。因此，这些gRNA在最终细胞群体中的比例增加。
测序结果：通过NGS测序，富集的gRNA在筛选后样本中的读数（reads）显著高于对照样本（筛选前或未受选择压力的样本）。

示例：

药物抗性筛选：假设研究者用一种抗癌药物处理细胞群。如果敲除某个基因（如抑制药物代谢的基因）使细胞对药物产生抗性，携带该基因gRNA的细胞会在药物处理后存活并增殖。这些gRNA在最终样本中的丰度会显著增加，表明该基因与药物抗性相关。
生物学意义：富集的gRNA指向的基因通常是负向调控表型的基因，敲除它们增强了细胞在特定条件下的适应性。

3.3 耗竭gRNA的原理

耗竭指的是在筛选后，某些gRNA的相对丰度显著低于初始状态。这表明敲除这些gRNA靶向的基因导致细胞在选择压力下存活或增殖能力下降，通常是因为这些基因对细胞存活或表型至关重要。

机制：

选择劣势：当某个基因被敲除后，细胞在选择压力下失去存活或增殖能力。例如，敲除一个对细胞存活必需的基因会导致细胞死亡或生长受限。
细胞耗竭：携带这些gRNA的细胞在选择压力下被淘汰（死亡或停止增殖），而其他细胞继续存活。因此，这些gRNA在最终细胞群体中的比例减少甚至消失。
测序结果：通过NGS测序，耗竭的gRNA在筛选后样本中的读数显著低于对照样本。

示例：

必需基因筛选：在细胞存活筛选（不加额外选择压力）中，敲除某些基因（如DNA修复或代谢通路中的关键基因）会导致细胞死亡。携带这些gRNA的细胞在筛选后逐渐消失，因此这些gRNA的丰度显著降低，表明这些基因对细胞存活至关重要。
生物学意义：耗竭的gRNA指向的基因通常是正向调控表型的基因，敲除它们削弱了细胞的适应性。

3.4 定量分析gRNA丰度变化

gRNA丰度的变化通过以下步骤定量分析：

DNA提取与测序：从筛选前（T0）和筛选后（T1）的细胞群中提取基因组DNA，扩增gRNA序列并进行高通量测序。
读数比较：计算每个gRNA的测序读数（reads），并将其归一化到总读数，得到相对丰度。
富集/耗竭计算：
- 富集：T1样本中gRNA的相对丰度显著高于T0（通常用log2倍变化或统计显著性p值评估）。
- 耗竭：T1样本中gRNA的相对丰度显著低于T0或接近零。
统计分析：使用工具如MAGeCK或BAGEL，基于gRNA丰度变化计算基因水平的显著性，考虑多条gRNA的一致性以减少假阳性。

富集与耗竭的生物学意义

富集gRNA：指示敲除该基因赋予细胞竞争优势，可能与抑制性基因（如肿瘤抑制基因在癌症研究中）相关。例如，在药物筛选中，富集gRNA可能指向药物代谢或信号通路的负调控因子。
耗竭gRNA：指示敲除该基因导致细胞劣势，通常与必需基因（如细胞周期、DNA修复或代谢通路中的基因）相关。例如，在存活筛选中，耗竭gRNA可能指向细胞存活必需的核心基因。