TAIR，NASCarray 和 EBI 都有一些公开的免费芯片数据可以下载。本专题使用的数据来自NASCarray（Exp350），也可以用FTP直接下载。下载其中的CEL文件即可（.CEL.gz），下载后解压缩到同一文件夹内。该实验有1个对照和3个处理，各有2个重复，共8张芯片（8个CEL文件）。
为什么要进行芯片质量分析？不是每个人做了实验都会得到高质量的数据，花了钱不一定就有回报，这道理大家都懂。
芯片实验有可能失败，失败的原因可能是技术上的（包括片子本身的质量），也可能是实验设计方面的。芯片质量分析主要检测前者。
使用到两个软件包：affy，simpleaffy：
library(BiocInstaller)biocLite(c("affy","simpleaffy"))
另外还需要两个辅助软件包：tcltk和scales。tcltk一般R基础安装包都已经装有。
install.packages(c("tcltk","scales"))
载入affy软件包：
library(affy)library(tcltk)
选取CEL文件。以下两种方法任选一种即可。
第一种方法是通过选取目录获得某个目录内(包括子目录）的所有cel文件：
# 用choose.dir函数选择文件夹
dir<-tk_choose.dir(caption="Select folder")
# 列出CEL文件，保存到变量
cel.files<-list.files(path=dir, pattern=".+\\.cel$", ignore.case=TRUE, full.names=TRUE, recursive=TRUE)
# 查看文件名basename(cel.files)
第二种方法是通过文件选取选择目录内部分或全部cel文件：
# 建立文件过滤器
filters<-matrix(c("CEL file",".[Cc][Ee][Ll]","All",".*"),ncol=2,byrow= T)
# 使用tk_choose.files函数选择文件
cel.files<-tk_choose.files(caption="Select CELs",multi=TRUE,filters= filters,index=1)
# 注意：较老版本的tk函数有bug，列表的第一个文件名可能是错的
basename(cel.files)
## [1] "NRID9780_Zarka_2-1_MT-0HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [2] "NRID9781_Zarka_2-2_MT-0HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [3] "NRID9782_Zarka_2-3_MT-1HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [4] "NRID9783_Zarka_2-4_MT-1HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [5] "NRID9784_Zarka_2-5_MT-24HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [6] "NRID9785_Zarka_2-6_MT-24HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [7] "NRID9786_Zarka_2-7_MT-7DCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [8] "NRID9787_Zarka_2-8_MT-7DCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
读取CEL文件数据使用ReadAffy函数，它的参数为：
# Not run. 函数说明，请不要运行下面代码ReadAffy(...,filenames=character(0),widget=getOption("BioC")$affy$use.widgets,compress=getOption("BioC")$affy$compress.cel,celfile.path=NULL,sampleNames=NULL,phenoData=NULL,description=NULL,notes="",rm.mask=FALSE,rm.outliers=FALSE,rm.extra=FALSE,verbose=FALSE,sd=FALSE,cdfname=NULL)
除文件名外我们使用函数的默认参数读取CEL文件：
data.raw<-ReadAffy(filenames= cel.files)
读入芯片的默认样品名称是文件名，用sampleNames函数查看或修改：
sampleNames(data.raw)
## [1] "NRID9780_Zarka_2-1_MT-0HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [2] "NRID9781_Zarka_2-2_MT-0HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [3] "NRID9782_Zarka_2-3_MT-1HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [4] "NRID9783_Zarka_2-4_MT-1HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [5] "NRID9784_Zarka_2-5_MT-24HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [6] "NRID9785_Zarka_2-6_MT-24HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [7] "NRID9786_Zarka_2-7_MT-7DCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [8] "NRID9787_Zarka_2-8_MT-7DCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
sampleNames(data.raw)<-paste("CHIP",1:length(cel.files),sep="-")sampleNames(data.raw)
## [1] "CHIP-1" "CHIP-2" "CHIP-3" "CHIP-4" "CHIP-5" "CHIP-6" "CHIP-7" "CHIP-8"
Phenotypic data数据可能有用，可以修改成你需要的内容，用pData函数查看和修改：
pData(data.raw)
## sample
## CHIP-1 1
## CHIP-2 2
## CHIP-3 3
## CHIP-4 4
## CHIP-5 5
## CHIP-6 6
## CHIP-7 7
## CHIP-8 8
pData(data.raw)$Treatment<-gl(2,1,length=length(cel.files),labels=c("CK","T"))pData(data.raw)
## sample Treatment
## CHIP-1 1 CK
## CHIP-2 2 T
## CHIP-3 3 CK
## CHIP-4 4 T
## CHIP-5 5 CK
## CHIP-6 6 T
## CHIP-7 7 CK
## CHIP-8 8 T
PM和MM查看：
# Perfect-match probespm.data<-pm(data.raw)head(pm.data)
## CHIP-1 CHIP-2 CHIP-3 CHIP-4 CHIP-5 CHIP-6 CHIP-7 CHIP-8
## 501131 127.0 166.3 112.0 139.8 111.3 85.5 126.3 102.8
## 251604 118.5 105.0 82.0 101.5 94.0 81.3 103.8 103.0
## 261891 117.0 90.5 113.0 101.8 99.3 107.0 85.3 85.3
## 230387 140.5 113.5 94.8 137.5 117.3 112.5 124.3 114.0
## 217334 227.3 192.5 174.0 192.8 162.3 163.3 235.0 195.8
## 451116 135.0 122.0 86.8 93.3 83.8 87.3 97.3 83.5
# Mis-match probesmm.data<-mm(data.raw)head(mm.data)
## CHIP-1 CHIP-2 CHIP-3 CHIP-4 CHIP-5 CHIP-6 CHIP-7 CHIP-8
## 501843 89.0 88.0 80.5 91.0 77.0 75.0 79.0 72.0
## 252316 134.3 77.3 77.0 107.8 98.5 75.0 99.5 71.3
## 262603 119.3 90.5 82.0 86.3 93.0 89.3 94.5 83.8
## 231099 123.5 94.5 76.5 95.0 89.3 87.8 95.5 91.5
## 218046 110.3 93.0 74.8 100.5 86.0 89.5 104.5 102.3
## 451828 127.5 77.0 80.3 94.5 72.3 79.0 86.3 67.8
# 芯片数量n.cel<-length(cel.files)par(mfrow=c(ceiling(n.cel/2),2))par(mar=c(0.5,0.5,2,0.5))# 设置调色板颜色为灰度pallette.gray<-c(rep(gray(0:10/10),times=seq(1,41,by=4)))# 通过for循环逐个作图for(iin1:n.cel)image(data.raw[, i],col= pallette.gray)
如果芯片图像有斑块现象就很可能是坏片。
par(mfrow=c(1,1))par(mar=c(4,4,3,0.5))par(cex=0.7)if(n.cel>40)par(cex=0.5)# rainbow是R的一个函数，用于产生彩虹色cols<-rainbow(n.cel*1.2)boxplot(data.raw,col= cols,xlab="Sample",ylab="Log intensity")
par(mar=c(4,4,0.5,0.5))hist(data.raw,lty=1:3,col= cols)legend("topright",legend=sampleNames(data.raw),lty=1:3,col= cols,box.col="transparent",xpd=TRUE)
par(mfrow=c(ceiling(n.cel/2),2))par(mar=c(3,3,2,0.5))par(tcl=0.2)par(mgp=c(2,0.5,0))require(scales)col<-alpha("seagreen",alpha=0.01)MAplot(data.raw,col= col,loess.col="red",cex=0.9)
IQR差别大的芯片可能有问题，但芯片能不能用得看具体情况（参考其他指标）而定。
par(mfrow=c(1,1))par(mar=c(4,4,3,0.5))
RNAdeg<-AffyRNAdeg(data.raw)
summaryAffyRNAdeg(RNAdeg)
## CHIP-1 CHIP-2 CHIP-3 CHIP-4 CHIP-5 CHIP-6 CHIP-7
## slope 1.71e+00 1.67e+00 1.82e+00 1.9e+00 1.60e+00 1.73e+00 1.72e+00
## pvalue 2.31e-10 5.11e-11 4.74e-11 3.0e-11 2.84e-11 3.39e-12 1.31e-10
## CHIP-8
## slope 1.61e+00
## pvalue 7.84e-11
plotAffyRNAdeg(RNAdeg,cols= cols)
legend("topleft",legend=sampleNames(data.raw),lty=1,col= cols,box.col="transparent",xpd=TRUE)
box()
理想状况下各样品的线（分段）是平行的。从上面图上看芯片1可能有点问题。
library(simpleaffy)
# 计算芯片质量数据
qc.data<-qc(data.raw)
# 平均背景值，如果太大则表示可能有问题
(avbg.data<-as.data.frame(sort(avbg(qc.data))))
## sort(avbg(qc.data))
## CHIP-8 60.74
## CHIP-5 63.53
## CHIP-2 63.71
## CHIP-3 63.92
## CHIP-7 63.92
## CHIP-6 66.59
## CHIP-1 78.95
## CHIP-4 79.61
# 样品的scale factor(sfs.data<-sort(sfs(qc.data)))
## [1] 0.5689 0.6235 0.6905 0.6920 0.7660 0.8179 0.8191 0.8386
# affy建议每个样品间的sf差异不能超过3倍max(sfs.data)/min(sfs.data)
## [1] 1.474
# 表达基因所占的比例，太小则表示有问题as.data.frame(percent.present(qc.data))
## percent.present(qc.data)
## CHIP-1.present 58.27
## CHIP-2.present 62.10
## CHIP-3.present 62.98
## CHIP-4.present 60.95
## CHIP-5.present 58.02
## CHIP-6.present 59.35
## CHIP-7.present 62.66
## CHIP-8.present 62.30
# 内参基因的表达比例ratios(qc.data)
## actin3/actin5 actin3/actinM gapdh3/gapdh5 gapdh3/gapdhM
## CHIP-1 0.3860 -0.297736 0.3118 -0.9426
## CHIP-2 0.3999 -0.179446 0.3333 -0.6741
## CHIP-3 0.3891 -0.005161 0.5414 -0.7286
## CHIP-4 0.4889 -0.152291 0.5449 -0.7081
## CHIP-5 0.2049 -0.348223 0.4260 -0.6383
## CHIP-6 0.4554 -0.039076 0.2426 -0.8057
## CHIP-7 0.5528 -0.226408 0.4426 -0.5121
## CHIP-8 0.4545 -0.152246 0.2308 -0.8548
sessionInfo()
## R version 3.1.0 (2014-04-10)
## Platform: x86_64-pc-linux-gnu (64-bit)
##
## locale:
## [1] LC_CTYPE=zh_CN.UTF-8 LC_NUMERIC=C
## [3] LC_TIME=zh_CN.UTF-8 LC_COLLATE=zh_CN.UTF-8
## [5] LC_MONETARY=zh_CN.UTF-8 LC_MESSAGES=zh_CN.UTF-8
## [7] LC_PAPER=zh_CN.UTF-8 LC_NAME=C
## [9] LC_ADDRESS=C LC_TELEPHONE=C
## [11] LC_MEASUREMENT=zh_CN.UTF-8 LC_IDENTIFICATION=C
##
## attached base packages:
## [1] parallel tcltk stats graphics grDevices utils datasets
## [8] methods base
##
## other attached packages:
## [1] simpleaffy_2.41.0 gcrma_2.37.0 genefilter_1.47.0
## [4] scales_0.2.4 ath1121501cdf_2.14.0 affy_1.43.0
## [7] Biobase_2.25.0 BiocGenerics_0.11.0 zblog_0.1.0
## [10] knitr_1.5
##
## loaded via a namespace (and not attached):
## [1] affyio_1.33.0 annotate_1.43.2 AnnotationDbi_1.27.3
## [4] BiocInstaller_1.15.2 Biostrings_2.33.3 colorspace_1.2-4
## [7] DBI_0.2-7 evaluate_0.5.3 formatR_0.10
## [10] GenomeInfoDb_1.1.2 highr_0.3 IRanges_1.99.2
## [13] munsell_0.4.2 plyr_1.8.1 preprocessCore_1.27.0
## [16] Rcpp_0.11.1 RSQLite_0.11.4 S4Vectors_0.0.2
## [19] splines_3.1.0 stats4_3.1.0 stringr_0.6.2
## [22] survival_2.37-7 tools_3.1.0 XML_3.98-1.1
## [25] xtable_1.7-3 XVector_0.5.3 zlibbioc_1.11.1
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