miRNA是一类长度仅为19 - 25个碱基的内源性非编码单链核糖核酸。由于其长度极短，导致科研者无法像对待长链RNA那样直接进行常规逆转录。目前，解决miRNA逆转录难题的最佳方案就是对miRNA进行“延长”，主流方法分加尾法和茎环法两种。本文将介绍其相关原理及常见问题。
一、miRNA逆转录原理
1、miRNA加尾逆转录原理
该原理是通过PolyA聚合酶（PAP）在miRNA的3’端后面添加一条PolyA尾巴，增加其长度，改造成 mRNA的结构，再将逆转录引物 Oligo d(T) 结合到PolyA序列上，在逆转录酶的作用下完成加长版cDNA的合成。
2、miRNA茎环逆转录原理
miRNA茎环法逆转录的原理是利用一种稳定的双链结构--茎环(stem-loop)结构作为逆转录引物，与miRNA中目标序列互补结合，形成DNA/RNA复合体，随后利用逆转录酶将RNA序列逆转录为cDNA，从而实现miRNA表达的测量和分析等功能，其过程如下：
二、miRNA逆转录常见问题：
1、如何提高miRNA加尾法的逆转录效率？
miRNA加尾法的逆转录效率主要依赖于Poly A酶的活性和Oligo d(T)引物的结合效率。研究者可以选择BIOG的miRNA加尾逆转录试剂盒，盒内配置有工程优化的 Poly A 聚合酶，具有很高的加尾效率，能够高效快速地给miRNA 加上腺苷酸尾巴并提高miRNA的稳定性，同时为cDNA的合成提供Oligo d(T)引物结合位点，搭配百代特别设计的含 Oligo d(T)的引物，能够与 miRNA Poly A+高效结合，从而有效提高miRNA加尾法的逆转录效率。
2、miRNA加尾法逆转录的特点及应用？
其主要特点就是可以对样本中所有miRNA进行无差别逆转录，属于高通量逆转录，一次逆转录可检测多种miRNA，因此加尾法适用于多个miRNA (3个以上)的研究，即大量miRNA前期的筛选，因为一次逆转录可以进行多个miRNA的qPCR扩增，节省样本量的同时也更加方便。
3、miRNA加尾法逆转录和荧光定量实验中有哪些注意事项？
A.逆转录实验中，模板miRNA使用量范围可在 10pg~2ug 之间，即使提取的miRNA浓度低也可有效进行逆转录；如提取miRNA含量本身就低的样本，如血清、血浆等，则无需测浓度，可在提取后直接进行逆转录；
B.在荧光定量实验操作中，对于未稀释的cDNA模板，加样体积最好不超过2.0uL，对于丰度较高的miRNA，cDNA样本可适当稀释后再进行qPCR，稀释倍数可根据反应CT值而定；
C.miRNA逆转录试剂盒和miRNA qPCR试剂盒一般是配套的，研究者最好买同一公司配套的miRNA 逆转录试剂和qPCR试剂，否则，有可能出现失败的实验结果。其主要原因是逆转录引物上往往设计有PCR引物结合序列，如果买不同厂家的试剂，PCR引物可能无法特异地结合逆转录产物。百代生物可提供miRNA加尾法逆转录试剂盒及配套的荧光定量试剂盒，值得一提的是，其还可为研究者免费设计合成miRNA逆转录引物以及荧光定量上下游引物，大大节省了研究者的宝贵时间与实验成本。
4、如何提高miRNA检测的精确度？
研究者对实验结果的精确度有高要求时，建议选择miRNA茎环法逆转录和荧光定量。茎环法最大的特点就是其逆转录和qPCR都是序列特异性的，对于每一个待检测的miRNA都需要设计独特的逆转录引物以及qPCR引物，建议找设计经验丰富的生物公司进行设计如百代生物等，搭配其BIOG miRNA茎环法逆转录试剂盒与荧光定量试剂盒一起使用，可确保实验结果的特异性和灵敏度。尤其是其中针对性设计的茎环逆转录引物，一方面能够有效延长miRNA长度，另一方面又可利用自身的互补构象防止与其他序列结合，从而减少了非特异结合，提高实验结果的精确度，并且百代生物还可免费提供miRNA上下游引物的设计合成服务。
5、miRNA加尾法和茎环法的区别？
miRNA加尾法和茎环法的目的都是为了延长miRNA长度，其区别是：
1.延长方式不同：加尾法是对所有miRNA无差别化加上polyA尾巴来延长cDNA长度，而茎环法是通过设计带有茎环结构的引物与目的miRNA特异性结合来进行延长；
2.适用的实验需求不同：加尾法属于高通量逆转录，适用于大量miRNA的筛选检测；而茎环法属于特异性逆转录，适用于少量目标miRNA的精确定量检测；
另外，miRNA茎环法的检测灵敏度、特异性、精确度都要优于加尾法，研究者需要根据具体实验需求选择最合适的方法。
6、miRNA采用茎环法进行逆转录时，可以在一管中同时添加多个逆转录引物吗?
不建议！如若研究多个目的miRNA，则每个miRNA都需要分开进行逆转录，否则在一管中同时投入多个茎环引物进行多个miRNA逆转时，不同特异性茎环引物的茎环结构之间会产生相互干扰和影响。
但BIOG miRNA茎环法逆转录试剂盒有一些特别的设计，可在同一个逆转录体系中同时添加U6（内参）逆转录引物和茎环逆转录引物，两者可同时进行逆转录，而不会出现相互干扰和影响的问题。
