01一、文章信息
发表杂志名称：Cancer Cell
中文标题：感官神经元通过谷氨酸能神经元 - 癌症伪突触驱动胰腺癌进展
英文标题：Sensory neurons drive pancreatic cancer progression through glutamatergic neuron-cancer pseudo-synapses
影响因子：44.5
发表日期：2025 年 9 月 25 日
01二、研究概述
Ren 等人的研究证实了感官神经元与胰腺导管腺癌（PDAC）细胞之间存在伪突触连接。这些伪突触中，NMDA 受体亚基 GRIN2D/GluN2D 富集，增强了 PDAC 细胞对神经元来源谷氨酸的反应，进而促进肿瘤生长。在 PDAC 模型中，破坏伪突触处的谷氨酸 - GRIN2D 信号可改善小鼠生存状况，这一发现凸显了靶向癌症 - 神经元伪突触的治疗潜力。此外，研究还揭示了感官神经支配通过 TGFA-EGFR 信号的前馈环路调控 PDAC 细胞中 Grin2d 的上调，以及 Grin2d 在肿瘤生长、神经浸润等过程中的关键作用，为癌症神经科学指导的肿瘤治疗提供了新方向。
01三、研究结果
（一）GRIN2D 在 PDAC 中的表达及其功能意义
作者首先分析了患者来源的 PDAC 肿瘤活检样本和相应人腹腔神经节标本中谷氨酸受体亚型的表达，并扩展到 TCGA 数据库中的人 PDAC 组织，发现 GRIN2D 基因（NMDAR 家族成员）表达显著升高（图 1A、1B）。与正常胰腺相比，PDAC 中 GRIN1、GRIN2A 和 GRIN2D 表达均升高，且仅 GRIN2D 与 TNM 分期中的 T 期和 N 期显著相关（图 S1A、S1B、S1C）。在多种人类癌症中，GRIN2D 表达也高于正常组织（图 S1D），且在人 PDAC 样本中，GRIN1 和 GRIN2D 在 NMDAR 组件中存在显著共表达和相关性（图 S1E）。在人神经亲和性 SU.86.86、T3M4 细胞系和非神经亲和性 Panc-1、Capan-1 细胞系，以及小鼠神经亲和性 TPAC 细胞系和非神经亲和性 KPC 细胞系中，GRIN2D 在 NMDAR 亚型中表达最高，且与 GRIN1 共表达（图 S1F-S1K）。
通过对两个单细胞 RNA 测序数据集（70 个人 PDAC 肿瘤的 325,480 个细胞）分析，作者发现 GRIN2D 选择性富集在恶性上皮细胞中，在非恶性群体中表达极少（图 1C、1D、S2A-S2D），且未接受治疗的肿瘤中 GRIN2D 表达高于接受 FOLFIRINOX 治疗且应答不佳的肿瘤（图 S2E）。
为评估 L - 谷氨酸（GRIN2D 亚基的配体）的影响，作者测试了不同浓度 L - 谷氨酸对细胞的作用，发现 0.5μM L - 谷氨酸能最佳刺激癌细胞中 GRIN2D 转录，且不影响细胞生长（图 S2F-S2L）。神经亲和性细胞系 SU.86.86、T3M4、TPAC 在 L - 谷氨酸和 DRG 条件培养基（CM）处理下，迁移和侵袭能力增强，而非神经亲和性细胞 Panc-1、Capan-1、KPC 则无此变化（图 1E-1G）。用 GRIN2D 选择性拮抗剂 UBP145 预处理，可逆转 SU.86.86、T3M4、TPAC 细胞的迁移和侵袭行为，但对非神经亲和性细胞系无影响（图 1H、1I、S2M）。在 SU.86.86 和 Capan-1 细胞中沉默 GRIN2D（siGRIN2D），也产生了与 UBP145 类似的抑制效果，尤其在神经亲和性 SU.86.86 细胞中（图 1J-1L）。
综上，本部分结果表明 L - 谷氨酸通过 NMDAR 亚型 GRIN2D 增强了神经亲和性 PDAC 细胞的迁移表型。
（二）PDAC 中 GRIN2D/NMDAR 通路组件的检测
作者通过 RT-qPCR 检测了人 SU.86.86、Capan-1 细胞和小鼠 TPAC、KPC 细胞中 9 个谷氨酸转运体基因的水平，发现除人细胞中 SLC1A3 和小鼠细胞中 Slc7a11 表达较高外，其他转运体基因表达水平相当且较低，且 Western blot 分析显示 SLC1A3、SLC7A11 和 SLC17A6（突触小泡谷氨酸装载关键蛋白）在这些细胞系中含量极低（图 S3A-S3C）。
作者发现人 PDAC 组织中 GRIN2D 和 GRIN1 共表达且水平高于正常胰腺组织（图 S3D、S3E），进一步研究显示，在侵犯神经的癌细胞中，GRIN2D、GRIN1 和 DLG4 蛋白显著富集，而在未参与神经侵犯的癌细胞中则无此现象（图 2A）。同时，被癌细胞侵犯的神经中，VAMP1（突触小泡相关膜蛋白 1）和 SLC17A6（囊泡谷氨酸转运体 2）水平显著高于未被侵犯的神经（图 2B）。
DRG 条件培养基（CM）处理后，神经亲和性 SU.86.86、T3M4、TPAC 细胞中 GRIN1（Grin1）和 GRIN2D（Grin2d）表达上调，而非神经亲和性细胞中 GRIN1 和 GRIN2D mRNA 表达显著降低（图 S3）。Western blot 分析显示，DRG CM 处理显著增加人神经亲和性癌细胞系（尤其是 SU.86.86 细胞）中 GRIN2D、GRIN1 和 DLG4 的蛋白表达，而非神经亲和性 Panc-1 和 Capan-1 细胞中这些蛋白水平未改变或降低（图 S3F-S3H）。免疫细胞化学分析显示，在 SU.86.86-DRG 共培养物中，癌细胞中 GRIN2D、GRIN1、DLG4 和神经元中 VAMP1、SLC17A6 表达显著，而在 Capan1-DRG 共培养物中表达不明显（图 2C、2D）。与 DRG 共培养可提高神经亲和性 SU.86.86 和 T3M4 细胞中 GRIN1、GRIN2D 和 DLG4 的蛋白表达，但对非神经亲和性 Panc-1 和 Capan-1 细胞无此作用（图 S3I、S3J）。在 SU.86.86 细胞中敲除 GRIN2D 基因，可逆转上述效应并影响 GRIN1 和 DLG4 的诱导表达，而在 Capan-1 细胞中未观察到这种情况（图 S3K）。
综上，本部分结果表明癌细胞中特定 NMDAR 亚基（尤其是 GRIN2D）的表达伴随着神经元中突触前谷氨酸转运蛋白的表达。
（三）L - 谷氨酸通过 CAMK IV-CREB 通路和 E2F1 介导的 EZH2 激活触发 GRIN2D 表达
利用 ARCHS4 数据库，作者发现 Zeste 2 多梳抑制复合物 2 亚基增强子（EZH2）是调控人细胞中 GRIN2D 表达的最潜在重要转录因子（TF）。在 TCGA 数据集中，人 PDAC 细胞中仅 GRIN1 和 GRIN2D 与 EZH2 表达共表达且呈正相关（图 S4A、S4B）。染色质免疫沉淀 PCR（ChIP-PCR）实验发现 GRIN2D 基因区域内有两个潜在的 EZH2 结合位点（图 S4C），且 SU.86.86 细胞经 L - 谷氨酸处理后，EZH2 与 GRIN2D 的结合富集增加（图 3A）。L - 谷氨酸处理后，仅神经亲和性人 PDAC 细胞中 GRIN2D 和 EZH2 水平同步升高，非神经亲和性 PDAC 细胞中无此效应（图 S4D）。免疫细胞化学分析显示，L - 谷氨酸和 DRG CM 均能上调 SU.86.86 细胞中 EZH2 水平，但对 Capan-1 细胞无此作用（图 3B）。在 EZH2 siRNA 沉默组中，经 L - 谷氨酸和 DRG CM 处理后，GRIN2D 水平显著降低（图 3C、3D）。
已知 E2F 转录因子 1（E2F1）是 EZH2 表达的关键转录因子，作者发现 SU.86.86 细胞中沉默 E2F1 后，E2F1 在 EZH2 启动子处的富集显著减少（图 3E），且鉴定出 EZH2 启动子上三个相应的 E2F1 结合位点（图 S4E）。siRNA 介导的 E2F1 沉默后，SU.86.86 细胞中 EZH2 表达显著下调（图 3F）。
作者进一步研究 EZH2-E2F1 信号通路对 GRIN2D 的调控作用，发现 SU.86.86 细胞经 L - 谷氨酸或 DRG CM 处理后，EZH2-E2F1 轴信号分子（EZH2、H3K27me3、pRB Ser780、E2F1、CyclinD1、CDK4）蛋白水平升高，而 CDKN2A 表达降低，Capan-1 细胞中这些蛋白表达无差异（图 3G、S4F-S4H）。L - 谷氨酸处理使 SU.86.86 细胞中 EZH2 和 H3K27me3 水平升高、CDKN2A 表达降低，而转染 EZH2 siRNA 可逆转 CDK2NA 和 H3K27me3 的表达变化（图 S4I）。此外，siRNA 下调 EZH2 可导致经 L - 谷氨酸和 DRG CM 处理的 SU.86.86 细胞中 E2F1 和 pRB Ser780 减少（图 S4J）。
已知谷氨酸（尤其是配体刺激的 NMDAR 激活）会触发神经元钙内流，进而启动下游钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 4（CAMK4）通路，且 EZH2 表达受 Ser133 磷酸化的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白 1（CREB1）正调控。作者发现 SU.86.86 细胞经 L - 谷氨酸处理后，CAMK4 和 pCREB1 Ser133 同步激活（图 S4K），而 CAMK4 沉默后，这些变化被消除，且谷氨酸依赖性 EZH2 水平降低（图 3H、S4L）。
通过神经元 - 癌细胞共培养中的钙成像记录，作者证实人 SU.86.86 细胞中存在功能性含 GRIN2D 的 NMDA 受体，谷氨酸诱导的反应呈剂量依赖性，且可被特定 NMDA 受体拮抗剂（如 UBP141 和 AP5）调节，胰腺癌细胞静息膜电位为 - 50.07±3.33mV（图 3I-3L、S4M）。单独培养的 SU.86.86 细胞无此反应，表明神经元与癌细胞的物理接近 / 接触对胰腺癌细胞中 GRIN2D 信号的正常运作至关重要（图 3M）。此外，SU.86.86 细胞与神经元共培养时，在无外部刺激情况下出现自发性钙内流，该活动主要依赖 L 型和 T 型钙通道而非 L - 谷氨酸，提示 GRIN2D 可能作为谷氨酸 “传感器”，伪突触处癌细胞的钙内流可能由感觉神经元激活诱导（图 S4N）。作者还证实，外源性应用 NMDA 可特异性激活共培养小鼠 DRG 神经元的 SU.86.86 细胞上的 Ca²⁺电流，单独培养的 SU.86.86 细胞无此反应（图 S4O、S4P）。
综上，本部分结果表明 L - 谷氨酸通过激活 CAMK4-CREB1 信号通路和 EZH2-E2F1-p-Rb 信号通路，调控 PDAC 中 GRIN2D 的表达，且含 GRIN2D 的谷氨酸能受体在癌细胞上具有功能性。
（四）小鼠胰腺癌细胞中的 Grin2d 对肿瘤生长和神经浸润至关重要
为阐明 Grin2d 在癌细胞中的生物学意义，作者采用短发夹 RNA（shRNA）敲低（shGrin2d）和 CRISPR-Cas9 系统敲除（Grin2d⁻/⁻）两种方法，在具有高再增殖率的商业可用 KPC-Pdx1CRE 细胞系中进行基因编辑。该细胞系在 Pdx1 启动子控制下表达 Cre 重组酶，并携带条件性表达的 Trp53 R175H 突变等位基因，与 Li-Fraumeni 人同源物 TP53 R175H 类似。作者发现 KPC-Pdx1CRE 细胞中 Grin2d 的表达水平与 TPAC 相当，且均高于原代 KPC 细胞，免疫荧光染色显示 KPC-Pdx1CRE 移植小鼠肿瘤中基础 GRIN2D 水平高于 KPC 小鼠肿瘤（图 S5A、S5B）。RT-qPCR 和 Western blot 验证显示，生成的 shGrin2d 细胞中 Grin2d 在 mRNA 和蛋白水平均显著降低（图 4A）；在 Grin2d 敲除细胞中，用内含子 gRNA 靶向 Grin2d 基因的关键外显子 3，导致蛋白完全缺失（图 4B）。
功能表征显示，通过侵袭、迁移和伤口愈合实验检测，shGrin2d 和 Grin2d⁻/⁻细胞对 L - 谷氨酸和 DRG CM 处理无反应（图 S5C-S5G）。MTT 实验评估显示细胞代谢活性无差异，集落形成特性也无差异（图 S5H-S5K）。
为验证体内 Grin2d 缺失的影响，作者将 KPC-Pdx1CRE Grin2d⁻/⁻和 shGrin2d 细胞，以及相应的对照细胞（Grin2d⁺/⁺和 shNT，Grin2d 基因未修饰）原位植入 6 周龄雌性 C57BL/6N 小鼠胰腺（图 4C）。结果显示，植入 shGrin2d 和 Grin2d⁻/⁻细胞组的小鼠总生存期显著高于相应对照组（图 4D）。
生存期延长对应着 shGrin2d 和 Grin2d⁻/⁻组与对照组相比，肿瘤生长速率降低（监测至植入后 55 天）。此外，实验终点时肿瘤体积显著减小，导致胰腺重量降低，腹膜转移数量也减少（图 4E、S6A-S6F）。而且，shGrin2d 和 Grin2d⁻/⁻组小鼠胰腺中谷氨酸水平降低，但支配胰腺的 T8-T12 DRG 中谷氨酸水平升高，血清谷氨酸水平无变化（图 4F、4G、S6G、S6H）。Grin2d⁻/⁻和 shGrin2d 肿瘤中切割的 caspase9 水平升高，这也可以解释肿瘤体积的减小（图 4H、S6I）。此外，与相应对照组相比，shGrin2d 和 Grin2d⁻/⁻组肿瘤及其周围组织的神经浸润减少，表现为外周神经元的主要标志物 PGP9.5 水平降低（图 4I、S6J）。同时，shGrin2d 和 Grin2d⁻/⁻组中 GRIN2D 的蛋白表达降低，且 Grin2d 基因表达的上游调节因子转录因子 EZH2 和 CaMK4 也下调（图 4I、S6J）。
综上，本部分结果表明癌细胞中 Grin2d 的表达在体内肿瘤进展和神经浸润中起着关键作用，可能触发感觉背根神经节神经元中谷氨酸的过度产生，从而启动癌细胞与感觉神经元之间的正反馈循环，在体内驱动肿瘤生长。
（五）GRIN2D 敲除对癌细胞肿瘤周围神经发生的影响
为揭示 Grin2d 介导的肿瘤神经浸润的潜在分子机制，作者对原位植入的 Grin2d⁻/⁻和 Grin2d⁺/⁺肿瘤进行了 mRNA 测序。在候选基因中，7 个神经营养因子或受体（Fgf1、Fgfr4、Egfr、Gmfg、Tgfb1i1、Efnb1、Tgfa）被视为潜在的神经浸润介质（图 5A、S7A）。通过 RT-qPCR 进一步验证，发现 Egfr 及其配体转化生长因子 α（TGFA）在 Grin2d⁻/⁻植入肿瘤中显著下调，成为研究重点（图 5B）。在 Grin2d 编辑的 KPC-Pdx1CRE 细胞中，EGFR 蛋白水平也呈现类似趋势（图 S7B）。
作者在体外探索了 TGFA 对 DRG 神经元的影响，发现重组 TGFA 处理后小鼠 DRG 神经元中 EGFR 激活（图 5C），且轴突生成增加（图 5D、S7C）。免疫组织化学染色证实，在 Grin2d⁻/⁻和 shGrin2d 原位植入肿瘤中，EGFR 及其配体 TGFA 水平降低（图 5E、S7D）。
作者随后探究是否是感觉神经及其释放的 L - 谷氨酸驱动癌细胞中 Grin2d 的表达，在体外采用辣椒素消融 TRPV1⁺ DRG 神经元。结果显示，DRG 神经元数量增加与 KPC-Pdx1CRE 细胞 - 神经元共培养物中 TRPV1 表达升高相关（图 S7E）。将 KPC-Pdx1CRE 细胞与经辣椒素预处理的 DRG 共培养，免疫细胞化学染色显示 TRPV1 表达降低（图 5F、S7F、S7G）。通过 ELISA 测量共培养物（KPC-Pdx1CRE 细胞与不同数量 DRG）裂解物和 / 或上清液中的 TRPV1、P 物质（SP）和 CGRP，结果显示即使在 KPC-Pdx1CRE 细胞中 Grin2d 被敲除，其表达也降低，与辣椒素处理效果相似（图 5G-5I、S7H）。此外，经辣椒素处理的 KPC-Pdx1CRE-DRG 共培养物中 GRIN2D 含量降低，而 L - 谷氨酸处理可逆转这种降低（图 5J）。
综上，本部分结果表明 GRIN2D 触发的 EGFR-TGFA 信号在促进 PDAC 肿瘤周围神经浸润中起作用，且感觉神经元以谷氨酸依赖的方式调节癌细胞 GRIN2D 的表达。
（六）感觉神经元消融后癌细胞中 GRIN2D 敲除的影响
为在体内验证上述观察结果，作者将 KPC-Pdx1CRE-Grin2d⁻/⁻和相应的对照细胞（KPC-Pdx1CRE-Grin2d⁺/⁺）植入 42 日龄 C57BL/6N 小鼠（雌雄均有）胰腺，这些小鼠在出生后第 2 天（P2）通过腹腔注射辣椒素进行感觉神经消融（图 6A）。结果显示，实验终点时 Grin2d⁻/⁻组肿瘤体积显著减小，胰腺重量降低。重要的是，仅当 Grin2d 完整（Grin2d⁺/⁺）时，外源性（腹腔注射）谷氨酸供应可逆转辣椒素处理小鼠的肿瘤缩小，而溶剂处理对照组肿瘤大小无增加（图 6B、6C、S8A、S8B）。此外，P2 小鼠经辣椒素处理后，成年时 T8-T12 DRG 中的神经元密度降低（图 6D）。感觉纤维消融还通过 T8-T12 DRG 中 TRPV1 和 NF200 密度降低得到进一步证实（图 6E），且辣椒素处理后肿瘤组织中 TRPV1⁺或 NF200⁺神经纤维也相应减少（图 6F）。
作者还利用 Trpv1 敲除小鼠研究感觉神经元消融对 PDAC 进展的影响。与 Grin2d⁻/⁻ KPC-Pdx1CRE 植入模型中观察到的 TGFA 促神经发生效应一致，与 Trpv1 野生型（WT）神经元相比，Trpv1 敲除（KO）DRG 神经元上清液和细胞裂解物中 TGFA 分泌减少，且 L - 谷氨酸水平也降低（图 S9A、S9B）。尽管 KPC-Pdx1CRE 和 TPAC 细胞与 Trpv1 敲除 DRG 共培养可增强 TGFA 释放，但分泌水平仍低于与 Trpv1 野生型 DRG 共培养的水平。值得注意的是，与 TPAC 细胞相比，KPC-Pdx1CRE 细胞与 Trpv1 野生型 DRG 共培养时，细胞外 TGFA 分泌增加更多，尽管 TPAC 细胞基线 TGFA 分泌更高，且 KPC-Pdx1CRE 细胞内 TGFA 水平增加更显著（图 S9B）。
为增强癌细胞的神经亲和力，作者在 Grin2d⁺/⁺和 Grin2d⁻/⁻ KPC-Pdx1CRE 细胞中，在 EF1a 启动子下稳定过表达小鼠 Tgfa 基因。Western blot 证实，生成的 Grin2d⁺/⁺；Tgfa-Tg 和 Grin2d⁻/⁻；Tgfa-Tg KPC-Pdx1CRE 细胞系中 TGFA 蛋白水平显著增加（图 6G）。在 3D 迁移实验中，KPC-Pdx1CRE 细胞表现出与 TPAC 细胞相似的神经亲和生长能力，且对野生型 DRG 的侵袭性高于 KPC 细胞系，Tgfa 表达上调进一步增强了这种能力，但对 Trpv1 敲除 DRG 的侵袭性显著降低（图 S9C）。
作者将过表达或不过表达 Tgfa 的癌细胞原位植入 Trpv1 敲除和 C57BL/6N 野生型小鼠（6-8 周龄，雌雄均有）胰腺，形成四个实验组：Grin2d⁺/⁺、Grin2d⁻/⁻、Grin2d⁺/⁺；Tgfa-Tg、Grin2d⁻/⁻；Tgfa-Tg（图 6H）。研究终点时，尽管 Trpv1 敲除小鼠中 Grin2d⁺/⁺；Tgfa-Tg 组肿瘤显著大于 Grin2d⁺/⁺组，但其肿瘤体积仍明显小于 Trpv1 野生型 Grin2d⁺/⁺；Tgfa-Tg 组，后者肿瘤生长最显著（图 6I）。
作者通过 von Frey 细丝测试量化了感觉神经元消融后实验小鼠的疼痛感觉。Trpv1 野生型小鼠对 von Frey 细丝机械刺激的基线敏感性显著高于 Trpv1 敲除小鼠。在 Trpv1 野生型小鼠中，与 Grin2d⁻/⁻；Tgfa-Tg 组相比，移植 Grin2d⁺/⁺；Tgfa-Tg 细胞的小鼠肿瘤更大，且机械疼痛敏感性更高。疼痛感觉的增加比植入相同基因编辑细胞的 Trpv1 敲除小鼠更显著，也超过了 Trpv1 野生型小鼠植入前的基线敏感性。值得注意的是，Trpv1 敲除小鼠在肿瘤植入后未表现出类似的疼痛敏感性增加，表明肿瘤相关机械疼痛存在 Trpv1 依赖机制（图 6J）。
为进一步阐明通过 TGFA-EGFR 信号的前馈环路，作者在 Tgfa 启动子内鉴定出两个预测的 EZH2 结合位点（图 S9D、S9E）。ChIP-PCR 分析显示，在 KPC-Pdx1CRE 细胞中沉默 Ezh2 显著降低其在 Tgfa 启动子处的富集，且在 Grin2d⁻/⁻ KPC-Pdx1CRE 细胞中，EZH2 在相同位点的富集也进一步降低（图 S9F、S9G）。在 KPC-Pdx1CRE 细胞中，Grin2d 及其上游调节因子 Ezh2 的缺失抑制了 EZH2-GRIN2D-TGFA 信号通路的信号转导分子（EGFR、E2F1、pCREB1 Ser133、TGFA）的表达水平（图 S9H）。值得注意的是，外源性 L - 谷氨酸应用无法完全恢复由 Grin2d 或 Ezh2 缺失引起的 E2F1 和 pCREB1 Ser133 的降低，而 TGFA 水平则部分恢复。相反，在 siNT 或 Grin2d⁺/⁺ KPC-Pdx1CRE 细胞中，这些信号蛋白在谷氨酸刺激下显著上调（图 S9I、S9J）。
作者的 RNA-seq 分析显示，小鼠胰腺癌细胞中 Grin2d 敲除导致 Cacna1h（Cav3.2，T 型钙通道）基因下调和 Cacna1c（Cav1.2，L 型钙通道）基因上调（图 S9K）。相应地，钙成像显示 Grin2d⁻/⁻细胞中钙内流完全消失，而 Grin2d⁺/⁺细胞中钙内流强烈（图 S9L），这表明 Cacna1h 表达降低会功能性损害钙进入。鉴于 Cacna1h 在低阈值瞬时钙内流中的作用，尽管 Cacna1c 上调，但其缺失仍可能导致观察到的信号缺陷。癌细胞常表现出由 L 型和 T 型电压依赖性钙通道（VdCCs）介导的自发性钙内流和膜去极化，这在与神经元共培养的突触后 PDAC 细胞中已观察到。NMDA 受体激活依赖于谷氨酸结合，谷氨酸可能来源于特定微结构域（即 “伪突触”，类似于三方突触）的局部释放。NMDA 受体激活可产生额外的独立钙电流。VdCCs 引起的自发性钙内流活动导致去极化，使 NMDA 受体更容易释放 Mg²⁺阻断。肿瘤环境中这种空间受限的谷氨酸能信号使 NMDA 受体局部激活和下游钙信号传导成为可能。这些发现支持一个模型：通过 VdCCs 的自发性去极化通过解除 Mg²⁺阻断降低 NMDA 受体的激活阈值，其中含 GRIN2D 的 NMDA 受体介导谷氨酸依赖性钙内流，补充胰腺癌细胞中基线电压依赖性钙信号。这些发现表明 Grin2d 通过 Cacna1h 调节钙稳态，可能影响 KPC-Pdx1CRE 细胞的行为。对 TCGA 数据集的进一步分析显示，CACNA1H 高表达与 PDAC 患者总生存期改善显著相关（图 S9M）。
综上，本部分结果表明感觉神经元消融后，Grin2d 敲除可影响 PDAC 肿瘤生长、神经浸润及相关疼痛感觉，且 Grin2d 通过调控钙通道和相关信号通路参与 PDAC 进展。
（七）感觉神经元通过神经元 - 癌症伪突触向人 PDAC 中的胰腺癌细胞提供谷氨酸
为探究神经元释放的谷氨酸是否能通过伪突触信号激活胰腺癌细胞中的 NMDAR，作者利用透射电子显微镜（TEM）检查了患者来源的 PDAC 标本中突触结构的存在。TEM 扫描显示了神经浸润的两种类型，即神经内浸润和神经周浸润（图 7A、S10A）。值得注意的是，在癌细胞周围观察到分散且分布明显的神经轴突（Ax），为神经元 - 癌症伪突触结构奠定了基础（图 7Aa1、7Aa2）。此外，作者发现高密度的突触前终扣与侵犯的癌细胞接触，其中既有大的致密核心小泡（可能含有神经肽），也有小的突触小泡（表明存在谷氨酸等分子神经递质）（图 7Ab）。
关键发现是，在人 PDAC 样本中，突触后膜上清晰可见高度组织化的深色电子致密区域，即突触后致密区（PSD）（图 7B1-7B3）。这与中枢神经系统（CNS）中已知的兴奋性突触超微结构一致，表明癌细胞膜上突触后受体的集中，且连接到突触后 GRIN2D 的神经元突触前具有释放和接收机制的组件。
健康神经中的轴 - 轴突触很少见，仅在神经横切面上偶尔可见；然而，作者在神经浸润部位发现了大量的神经元 - 癌症伪突触，即使在较小的神经单横切面上也是如此（图 7B）。TEM 图像进一步显示了在这些神经元 - 癌症伪突触中 GRIN1 和 SLC17A6 的免疫金染色（图 7C）。
为量化潜在的伪突触位点，作者测量了 19 个患者来源的 PDAC 标本中 GRIN2D、PANCK 和 SLC17A6 的共定位位点，结果平均为 43.02±6.96 个伪突触 /mm²（图 S10B-S10D）。此外，作者观察到，与植入 Grin2d⁻/⁻-KPC-Pdx1CRE 细胞的小鼠相比，植入 Grin2d⁺/⁺-KPC-Pdx1CRE 细胞的小鼠中，通过 DLG4、CK19 和 SLC17A6 共定位量化的潜在肿瘤伪突触位点数量增加（19.00±2.36 vs. 9.71±1.77 个伪突触 /mm²）（图 S10E、S10F）。而且，Grin2d⁻/⁻-KPC-Pdx1CRE 肿瘤中突触标志物 DLG4、VAMP1 和 SLC17A6 的表达显著低于 Grin2d⁺/⁺-KPC-Pdx1CRE 肿瘤（图 S10G、S10H）。
与对人 PDAC 标本的 TEM 分析一致，作者在体外进一步观察到，从转染了 Slc17a6-RFP 的神经元延伸出的轴突与转染了 GRIN2D-GFP 的 SU.86.86 癌细胞之间形成了神经元 - 癌症伪突触。这些伪突触在神经元 - 癌症接触位点周围显示出 SLC17A6 的分散分布（图 S10I1、S10I2）。为在体外进一步支持该假设，扫描电子显微镜（SEM）显示了终末轴突与癌细胞形成的伪突触（图 7Da）。在这里，神经轴突包裹并终止在癌细胞上，而癌细胞与突触前和突触后神经元之间的突触间隙相邻，形成神经元 - 癌症伪突触（图 7Db），3D 重建视频（Video S1）进一步展示了这一现象。值得注意的是，神经元 SLC17A6 红色斑点与 SU.86.86 GRIN2D-GFP 表达紧密相关，显示出神经元 - 癌症伪突触的位点（图 7E）。
综上，本部分结果为神经元和胰腺癌细胞建立伪突触以促进神经元谷氨酸传递给癌细胞提供了有力证据。
本研究围绕感官神经元与胰腺导管腺癌（PDAC）细胞的相互作用展开，首次证实了在脑外癌症（PDAC）中感官神经末梢与癌细胞之间存在伪突触连接。研究发现，这些伪突触中 NMDA 受体亚基 GRIN2D/GluN2D 选择性富集，使 PDAC 细胞对神经元来源的谷氨酸产生应答，进而促进肿瘤生长和扩散。通过一系列体内外实验，阐明了谷氨酸通过 GRIN2D 信号驱动 PDAC 进展的分子机制，包括 CAMK IV-CREB 通路和 E2F1 介导的 EZH2 激活调控 GRIN2D 表达，以及 GRIN2D 触发 EGFR-TGFA 信号促进肿瘤周围神经浸润等。同时，破坏伪突触处谷氨酸 - GRIN2D 信号可显著改善 PDAC 模型小鼠的生存状况。此外，研究还发现 GRIN2D 在多种人类癌症中表达升高，暗示其可能具有更广泛的临床意义。该研究不仅揭示了 PDAC 进展的新机制，还为开发以癌症 - 神经元伪突触为靶点的癌症神经科学指导的肿瘤治疗策略提供了重要理论依据和实验基础。
