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研究概述：
三阴性乳腺癌(TNBC)是一种侵袭性、致命性的恶性肿瘤。本研究着眼于激活抗肿瘤反应所必需的中间T细胞亚群和肿瘤微环境，旨在开发为TNBC患者量身定制的免疫治疗方法。
作者从GEO数据库中获取TNBC的scRNA-seq数据，采用多重策略分析和鉴定TNBC的T细胞异质性，重点研究CD8+和CD4+这2种T细胞亚型，通过结合METABRIC和GEO数据库，构建并验证了T细胞标记基因的预后风险模型。最后使用CIBERSORT分析TNBC的免疫浸润细胞，并探讨风险模型与免疫治疗反应之间的关系。
流程图：
研究结果：
一、TNBC的细胞构成
- （图2A）本研究共纳入10个TNBC单细胞样品。
（图2B）去除低质量细胞、归一化、整合和PCA后，将25932个细胞分为14个簇。
（图 2C）通过注释这些亚簇鉴定出7种细胞类型：内皮细胞（簇 12）、上皮细胞（簇 0、4、8）、组织干细胞（簇 6、13）、B 细胞（簇 7、10、14）、T 细胞（簇 1、2、5、11）、巨噬细胞（簇 3）和单核细胞（簇 9）。
2. 图D显示了不同样品中存在的细胞类型。图E-G显示了每种细胞类型的重要标记基因。
- （图3）根据文献中列出的标记基因，对获得的T细胞亚群分类和鉴定:
（1）CD4 T细胞高表达IL7R、FOXP3、CCR7（簇1、2、3、5、6、7、13、14、16、17）;
（2）CD8 T细胞高表达GZMH、CD8B、CD8A（簇0、4、8、9、10、11、12、15）。
二、与 T 细胞相关的细胞间相互作用分析
1. 图4利用Cellchat检测配体-受体对以及不同细胞之间的分子相互作用。
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配体-受体介导的细胞相互作用主要存在于MIF信号通路(MIF-CD74+CXCR4和MIF-CD74+ CD44)中(图D)。其中，配体-受体对MIF-CD74+CXCR4对该通路中贡献最大(图E)。ACKR3和CXCR2的基因表达也与该信号通路相关(图F)。
三、T细胞的轨迹
1. Monocle 2进行T细胞的伪时序分析，大致有7种分化状态，不同状态下2种亚型的含量不同。结果显示，T细胞分化为CD4+细胞和CD8+细胞(图5A)。
2. 随发育时间变化，基因分为4个簇，分别与淋巴细胞介导的免疫、蛋白折叠、免疫球蛋白和细胞质翻译相关(图5B)。图5C显示了6个T细胞标记基因的动态表达，可以看出它们的表达在不同的分化时期有所不同。
四、GO，KEGG和GSEA富集分析以阐明T细胞中标记基因的生物学功能
1.（图6A）GO富集结果表明，生物过程（BP）主要与细胞质翻译、抗原加工和呈递、T细胞活化调控、肽酶活性调节和白细胞-细胞粘附有关。
细胞成分（CC）主要与局灶黏附、基底细胞连接、细胞质核糖体、核糖体和核糖体亚基有关。
分子功能（MF）与核糖体的结构成分、钙调蛋白结合、MHC II类蛋白复合物结合、MHC蛋白复合物结合和未折叠蛋白结合有关。
2. （图6B）KEGG结果表明，标记基因主要富集在T细胞活化发挥作用的通路中，包括Th1、Th2和Th17细胞分化、细胞粘附分子、T细胞受体信号通路、肌动蛋白细胞骨架和PD-L1表达调控以及PD-1检查点信号通路。
3.（图6C）GSEA结果还涉及了T细胞受体信号通路。
五、预后模型的构建与验证
从单细胞数据中选择1299个标记基因的T细胞与METABRIC数据集的TNBC表达矩阵相交。随后，单变量Cox回归分析了METABRIC队列中106个潜在预后基因，之后进行Lasso和多变量Cox回归分析，确定4个基因（OPTN，TMEM176A，PKM和HES1）为独立的预后基因。
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将TNBC患者分为低危或高危组，在训练队列（METABRIC）和测试队列（GSE58812）中，高危组患者的预后都较差。此外，ROC曲线显示，训练队列（图7A）的AUC为>0.7，测试队列（图7B）的AUC为>0.65，表明四个预后基因是TNBC患者OS的较好预测因素。
六、TNBC与免疫细胞浸润及免疫检查点的相关性
1. 基于METABRIC数据集，使用CIBERSORT算法分析肿瘤浸润免疫亚群的比例，并在TNBC样本中构建了22个免疫细胞谱(图8A)。
2. 使用Estimate R包评估高危组和低危组患者的TME。免疫评分，基质评分或ESTIMATE 评分越高，TME中免疫或基质成分越多。本研究中，低危组的免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分较高，肿瘤纯度评分较低，表明低危组TNBC患者的肿瘤比例较低（图8B）。
3. （图8C）免疫细胞的浸润水平分析表明，T细胞CD8、幼稚T细胞、CD4记忆活化T细胞和T细胞γδ在低危组表达较高，而T细胞滤泡辅助细胞和调节性T细胞（Tregs）在高危组表达较高。另外，低危组中的静息树突状细胞和静息NK细胞与TNBC患者的生存预后不良有关。
5. （图8D）免疫检查点差异分析表明，B2M、CD8A、CD40、CD40LG、ICOS、IFNG、IL23A和PTPRC在低危组中表达较高，与TNBC患者生存预后不良相关。
研究总结：
本研究首先阐明了TNBC中T细胞在功能富集、细胞分化轨迹和细胞间通讯方面的异质性，并将OPTN、TMEM176A、PKM和HES1确定为独立的预后基因，该模型有助于预测乳腺癌的预后和对治疗的反应，为了解TNBC的T细胞异质性和相关预后风险模型提供了资源。
