1、冰水浴研磨与液氮研磨的优缺点
(1)冰水浴研磨:
冰水浴研磨容易出现因温度控制不好而导致的酶失活的现象
冰水浴研磨因为研磨时间长,细胞破碎更加充分,因此研磨效率高
(2)液氮研磨:
当植物样本很难进行冰水浴研磨时可以采用这种方法
液氮研磨由于研磨时间短,因此容易出现细胞破碎不够充分的情况。(因此在进行研磨时可以在研磨成粉末时,再用研磨杵大范围研磨。在吸胀的胚变成接近白色粉末时为止)
在研磨之后注意与提取液混合时使用漩涡振荡器进行振荡。为了防止在振荡过程中温度升高导致酶的失活和蛋白质的分解,可以几组进行切换轮着进行漩涡振荡。(共振荡400s的效果就是可以的)
尽量用差值法记录最终称取的样本的重量
2、使用蛋白质计量酶活性的意义
由于每次研磨样品,无法保证蛋白质的提取效率相同。因此需要用蛋白质浓度计量酶活性
3、蛋白质和酶提取时间
在进行实验时,蛋白质要同时进行提取。(比如都是上午进行提取)
4、用文献数据初步核实测量时是否出现问题
用自己的数据与文献进行比较。在相同的情况下,自己的数据应当与文献的数据差异不大。(如文献数据是个位数的酶活力,如果自己出现小于0或者上千的酶活力,就需要进行复查是否在测量时出现了问题。)
5、酶活体系可能出现的问题以及可能原因
(1)差值过小
对照两组的酶含量都过低
反应体系不适合,无法进行充分反应
(2)差值过大
反应体系太小,即使是活力较低的组别,反应体系也无法承载(因此在进行实验之前,要确定反应体系能否承载自己的反应)
6、测量酶活时的实验步骤顺序
先测量样品的蛋白质浓度,若浓度相近时,才可以进行下一步实验。
在有些对实验更加严格的实验中,要首先确定蛋白质浓度,然后把蛋白质浓度统一后,才能再进行酶活力测量。
(?)稀释蛋白的浓度和稀释酶活的浓度应该是相同的(?)
7、测量时应注意的事项
在检测酶活时应尽量使用相同的体系。
在使用如96孔板进行测量时,应设置空白对照以及测量空白板的数据进行校正。
在使用比色皿用分光光度计进行测量时,注意空白对照组应与测量组使用相同的比色皿以减小误差。