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time：02/20/2024
journal：Cell report medicine （IF=14.3）
Objective:
免疫检查点抑制剂，尤其是 PD-1/PD-L1 阻断剂，已被批准用于治疗不可切除的肝细胞癌（HCC）。然而，高耐药率仍然限制了它们的疗效，这凸显了了解其潜在机制并开发克服耐药策略的迫切需要。
summary
Results:
figure1
fig1a: 为了研究 HCC 中抗 PDL1/PD-1 耐药的潜在机制，使用同基因小鼠肿瘤模型来生成体内耐药模型
fig1b：肿瘤生长证明亲本 Hepa1-6 肿瘤对抗 PD-L1 治疗敏感，与用 IgG 治疗的肿瘤相比，肿瘤生长显著下降。
fig1c: 生存分析显著。（作者也做了原位模型证明）
fig1d:蛋白组测序差异分析。
fig1e-f：Western blot和免疫组织化学（IHC）染色均证实PD-L1耐药的HCC细胞和耐药小鼠模型的肿瘤组织中p-MerTK和MerTK蛋白的表达显著增加。
fig1g: 在人的数据中看MerTK的情况。
fig1h: 做了敲除和过表达模型，发现携带 Res1-6-shMerTK肿瘤的小鼠对抗 PD-L1 治疗敏感，肿瘤生长显著减少。
fig1I: PD-L1 疗法显著降低了携带 Hepa1-6 肿瘤的小鼠的肿瘤生长，但没有降低携带 Hepa1-6OE-MerTK 肿瘤的小鼠的肿瘤生长。所以认为MerTK抑制anti-PD-L1治疗
figure2
fig2a：差异蛋白KEGG分析，铁死亡通路。（为什么选了这个通路，no pvalue，no ranking first，no direction.）
fig2b：用铁死亡诱导剂和抑制剂做实验：与 Hepa1-6 细胞相比，诱导剂处理显著降低了 Res1-6 细胞中的脂质活性氧 (ROS) 水平，并且铁死亡抑制剂 Fer-1 或 DFO 消除了这些影响（为什么要看这个ROS指标：铁死亡是新发现的以过氧化脂质和活性氧堆积、游离铁增加为主要特征的程序性死亡方式，涉及谷胱甘肽代谢、铁代谢、脂质代谢和氧化应激生物学过程。）
fig2c: SYTOX Green 染色还证明 Res1-6 细胞对铁死亡诱导剂诱导的细胞死亡表现出显著抵抗力。诱导剂诱导的细胞死亡可以被铁死亡抑制剂 Fer-1 或 DFO 抑制。（虽然铁死亡诱导剂能作为抑制肿瘤转移的策略，但铁死亡对肿瘤发展的调控作用可能是双向的，如铁死亡机制促进EMT的同时也会抑制终末定植阶段癌细胞间质向上皮转化；诱导铁死亡会上调脂质代谢途径促进普通癌细胞增殖；诱导铁死亡在肿瘤免疫方面同时具有促癌和抑癌作用，而决定因素尚未明确。SYTOX Green 染色：死细胞，所以用了诱导剂，肿瘤细胞死了）
这些结果表明，铁死亡可能参与调节抗 PD-L1 耐药性，并提出了 MerTK 介导的抗 PD-L1 耐药性可能通过抑制肿瘤细胞铁死亡来实现的可能性。
fig2d-e：Hepa1-6和Hepa1-6-OE-MerTK细胞分别使用红色和绿色荧光染料标记进行标记，并在erastin处理条件下共培养，发现Hepa1-6-OE-MerTK细胞的存活率逐渐升高，而Hepa1-6细胞的存活率逐渐降低，且呈时间依赖性。（MerTK 坏 铁死亡 好）
fig2g-h: 在小鼠肿瘤模型中观察到与铁死亡相关的特征指标，包括脂质ROS和丙二醛（MDA）含量。 MerTK的过表达显著减少PD-L1治疗的Hepa1-6肿瘤小鼠的脂质ROS和MDA含量
fig2i-j :相反，在 PDL1 治疗的耐药肿瘤模型中，MerTK 的敲低显著增加脂质 ROS 和 MDA 含量
小结：MerTK 通过保护 HCC 细胞免于铁死亡来诱导抗 PD-L1 耐药性。（为啥是MerTK诱导的铁死亡 而不是 铁死亡影响了MerTK？ 是不是应该在加入诱导剂和抑制剂的组里看看MerTK的表达是不是有变化?）
figure3
fig3a: 差异表达蛋白的火山图表明，铁死亡抑制因子胱氨酸/谷氨酸转运蛋白（SLC7A11）是在蛋白质组水平分析中确定的首要基因之一，SLC7A11 是阻止铁死亡的关键介质。
fig3b-c：作者想证明 SLC7A11 介导的铁死亡抑制是否足以引起 MerTK 诱导的抗 PD-1/PD-L1 耐药性，作者检测了耐药肿瘤细胞和组织中 SLC7A11 的表达。 Western blot分析和IHC 染色显示，抗PD-L1耐药肿瘤细胞中SLC7A11水平显著升高。
（这里是想说 MerTK 导致SLC7A11高表达然后抑制铁死亡，导致耐药，然后评价这个SLC7A11的表达量够不够，这种如何去定量能不能诱导耐药，如果说只要在耐药组显著升高就算，那火山图不就说明了吗？本来就是差异显著的蛋白啊）
fig3d:接下来作者在人上做了验证，分析了接受anti PD-1/PD-L1 治疗的 HCC 患者中 SLC7A11 的表达，anti PD-L1/PD-1治疗耐药的HCC患者的SLC7A11表达水平更高
fig3e：Pearson相关分析显示anti PD-L1/PD-1治疗耐药的HCC患者中MerTK和SLC7A11的表达与呈正相关（在非耐药组中的情况呢？？）
只能说明MerTK 和 SCL7A11 在anti PD-L1耐药中共同高表达，如果想说明是MerTK导致的SCL7A11高表达，不是应该在OE和SH组中看这两个基因的表达情况吗？fig3i 回答这个问题
fig3f:为了进一步验证 HCC 中 SLC7A11 介导的铁死亡与抗 PD-L1 反应之间的相关性，作者在耐药老鼠模型比较了 Res1-6 和 Res1-6-shSLC7A11 肿瘤之间抗 PD-L1 治疗的反应
fig3g-h： 与 Res1-6 肿瘤相比，携带 Res1-6-shSLC7A11 肿瘤的小鼠对抗 PD-L1 治疗表现出更高的敏感性
fig3I-j: 为了证明 SLC7A11 是否对于 MerTK 诱导的抗 PDL1 耐药性至关重要，分析了带有 MerTK 的小鼠肿瘤模型中的 SLC7A11 表达。相应地，MerTK 过表达小鼠模型的皮下异种移植物中 SLC7A11 表达显著增加，另一方面，当MerTK被敲低时，耐药模型肿瘤组织中SLC7A11的表达下调
小结：分析表明 MerTK 抑制耐药性 HCC 中 SLC7A11 调节的铁死亡。
figure4
fig4a: 探究在耐药肿瘤中哪个下游信号通路被激活并介导 SLC7A11 的上调， Western blot 分析表明 ERK/SP1 通路发生显著改变。Res1-6 肿瘤细胞中 MerTK 敲低和 ERK 抑制剂处理均显著降低了 p-ERK、p-SP1 和 SLC7A11 的表达。
fig4b: 另一方面，Hepa1-6细胞中MerTK的过表达显著增加了SLC7A11蛋白表达，而ERK抑制剂处理降低了Hepa1-6-OE-MerTK细胞中SLC7A11蛋白表达
fig4c-d: 荧光探针检测显示，Hepa1-6-OE-MerTK 细胞降低了铁死亡诱导剂诱导的脂质 ROS 水平，而 ERK 抑制剂处理 Hepa16-OE-MerTK 细胞则增加了脂质 ROS 水平
fig4e:与Res1-6细胞相比，Res1-6-sh-MerTK细胞由erastin诱导的脂质ROS水平增加，并且Res1-6细胞中的ERK抑制剂处理增加了脂质ROS水平。
fig4f-g：Hepa1-6细胞中MerTK的过表达减少了铁死亡诱导剂诱导的细胞死亡，而Hepa1-6OE-MerTK细胞中的ERK抑制剂处理增加了铁死亡诱导剂诱导的细胞死亡
fig4h: 与Res1-6细胞相比，Res1-6-shMerTK细胞增加了铁死亡诱导剂诱导的细胞死亡，并且ERK抑制剂处理Res1-6细胞也增加了细胞死亡
小结：这些观察结果表明，MerTK 通过 ERK/SP1 通路抑制 SLC7A11 介导的铁死亡，从而产生抗 PD-L1 耐药性。
figure5
fig5a：为了探索MerTK在TME中的功能，在TCGA数据库中评估了MerTK表达与细胞毒性T细胞抗肿瘤活性之间的相关性，结果发现，在MerTK低表达的患者中，细胞毒性T细胞介导了总生存期的延长，而在MerTK高表达的患者中，细胞毒性T细胞没有介导总生存期的延长，表明 MerTK 降低了细胞毒性 T 细胞的抗肿瘤作用。（但是这个两条生存曲线怎么只有一个pvalue 怎么断断续续的）
fig5b： 此外，TCGA的数据库还显示MerTK的表达水平与细胞毒性CD8+T细胞的富集呈负相关
fig5c-g：mfIHC 进一步用于可视化人 HCC 组织微阵列中的 MerTK 表达和免疫子集，发现 MerTK 高表达的患者 CD8+ T 细胞浸润明显较低（图 5C 和 5D），而 MDSC（CD11b+、CD15+/CD14+）浸润较高（图e），MerTK 高表达组的 gMDSC（CD11b+、CD15+ 和 CD14）浸润明显较高（图f），高、低 MerTK 表达组之间 HCC 肿瘤组织中 mMDSC（CD11b+、CD15 和 CD14+）的富集没有显示出显著差异（图g）？（为什么这么区分MDSC？）
fig5h：HCC患者中MerTK表达水平与MDSCs比例呈显著正相关（QIF score是什么？？）
fig5I：进一步评估了稳定表达 MerTK 的小鼠模型的免疫学特征。与Hepa1-6肿瘤相比，MerTK过表达导致CD8+T细胞和IFNg+CD8+T细胞显着减少，MDSCs百分比增加
fig5j：Res1-6 中 MerTK 的敲低显着增加了 CD8+ T 细胞和 IFNg+CD8+ T 细胞的数量，并降低了 MDSC 的水平
这些数据表明，MerTK 通过招募 MDSC 并显著减少 CD8+ T 细胞和 IFNg+CD8+ T 细胞，有利于促肿瘤 TME，从而诱导抗 PDL1 耐药。
figure6
fig6a: 鉴于 MerTK 能够操纵铁死亡并有利于免疫抑制 TME，我们试图确定靶向 MerTK 是否可以增加铁死亡，从而增强 HCC 对抗 PD-L1 阻断的反应。我们在体外用不同种类的MerTK抑制剂（包括UNC5293、UNC2541、UNC1267和sitravatinib）处理Res1-6细胞，发现MerTK抑制剂可以有效抑制Res1-6细胞的活力。在这些药物中，与UNC5293、UNC2541和UNC1267等其他药物相比，sitravatinib在抑制Res1-6细胞方面的IC50要低得多。
fig6b:PI染色实验表明，西曲伐替尼在体外促进erastin诱导的Res1-6细胞铁死亡
fig6c:使用荧光探针观察到 Sitravatinib 增加了 Res1-6 细胞中由erastin诱导的脂质ROS水平
fig6d: 与单独使用erastin治疗相比，使用SYTOX Green染色测定进一步证实，当erastin和sitravatinib联合治疗时，Res1-6细胞的死亡显著增加
小结：靶向 MerTK 会增加erastin 诱导的 Res1-6 细胞的铁死亡。
fig6e: 进一步研究了西曲伐替尼在抗PD-L1耐药肿瘤模型中的治疗，并用西曲伐替尼、抗PD-L1抗体及其组合治疗携带Res1-6肿瘤的小鼠。与单一疗法或对照相比，联合疗法显着降低了皮下 Res1-6 肿瘤的肿瘤重量和肿瘤生长。
fig6f: 为了进一步验证联合治疗的疗效，建立了原位Res1-6小鼠模型, 观察到联合用药后肿瘤显着消退，肺转移数量减少，小鼠存活时间延长
figure7
fig7a-b: 为了进一步了解 Sitravatinib 和抗 PD-L1 组合的抗肿瘤反应，评估了 Res1-6 皮下肿瘤的免疫学特征。与对照组相比，Res1-6 肿瘤的流式细胞分析显示，接受 Sitravatinib 或联合抗 PD-L1 治疗的小鼠中 MDSC 显着减少。此外，与单独使用sitravatinib或抗PD-L1相比，联合治疗组中CD8+ T细胞、IFNg+CD8+ T细胞的浸润和IFN-g的分泌增加。此外，西曲伐替尼治疗组中 CSF3 的表达和 MDSC 浸润减少
fig7c: Western blot结果显示，sitravatinib可以有效抑制MerTK活性并下调SLC7A11表达，而两者联合使用对Res1-6肿瘤中p-MerTK和SLC7A11水平具有协同作用
fig7d: 与蛋白质印迹结果一致，联合治疗组中 p-MerTK 和 SLC7A11 的 IHC 评分显着低于其他组
fig7e-h： 然后，为了研究联合治疗后铁死亡的调节，评估了不同治疗的耐药肿瘤中指示铁死亡的生物标志物，例如脂质ROS和MDA含量。与单独使用每种药物相比，sitravatinib 和抗 PD-L1 组合显着增加了 Res1-6 肿瘤和 Res-HCA-1 肿瘤中脂质 ROS 和 MDA 含量的水平。
Summary：
作者通过实验探究了耐药anti-pd1的人群特点，首先构建老鼠模型，然后通过蛋白测序来找到MerTK，然后通路富集找到铁死亡，之后找到抑制铁死亡的SLC7A11，并证明MerTK 上调 SLC7A11 表达以抑制肿瘤细胞铁死亡，通过在肝细胞癌 (HCC) 中招募 MDSC 来促进促肿瘤 TME，并驱动抗 PD-L1 治疗耐药。靶向 MerTK 会增加铁死亡并减少 MDSC 募集，从而激活 CD8+ T 细胞并使 HCC 对抗 PD-L1 阻断敏感。
Data:
小鼠的蛋白测序和单细胞测序数据
All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper or the supplemental information.
（应该不给原始数据）
Sth to learn:
皮下和原味肿瘤模型的区别
如何串联上下游讲述一个完整的故事，但是MerTK和铁死亡的因果关系，没有完全理解
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