16.使用流式细胞将CD45+细胞分选出来，进行单细胞RNA-seq分析。用FNγ或媒介物对照刺激细胞24小时后提取对照组（非靶向gRNA），Arid2，Pbrm1和Brd7缺陷的B16F10细胞总RNA并递交到DFCI的Molecular Biology Core Facility进行测序，构建RNA文库，使用DESeq2和Cufflinks软件计算差异表达基因。
图A为使用tSNE对分选出来的CD45+标记的肿瘤细胞降维之后根据图B中的特异性世系标记基因的表达进行可视化，可以看到在CD45+标记的细胞包含了DC细胞，抑制肿瘤的M1样巨噬细胞，T细胞，NK细胞以及促进肿瘤的M2样巨噬细胞。
图B：热图中红色表示基因表达上调，蓝色表示基因表达下调。显示了在DC/树突状细胞的标记基因（左边1-5个基因组），M2样巨噬细胞的标记基因（Apoe）,M1样巨噬细胞的标记基因（ll1b），与T细胞增殖相关的基因（Cdk1和Pcna），T细胞效应因子基因（Ctla2a,Pdcd1和Gzmb）,T 细胞标记基因（Cd3e和Cd8a），NK 细胞标记基因（Ncr1）和B细胞标记基因（Cd79b和Cd79a）表达上调。
图C为对于图A中所示的每个k-平均簇，与对照B16F10肿瘤相比，在Pbrm1缺陷中显著过表达的基因进行GSEA分析（标记基因组），显示了在抑制肿瘤的M1样巨噬细胞，T细胞，NK细胞中产生抗肿瘤免疫相关的基因表达特征（IFNγ应答，IFNα应答和NF-κB的TNFα信号通路）在Pbrm1缺陷中显着富集。
图D，Pbrm1缺陷型与对照B16F10肿瘤在总CD45 +细胞表示细胞簇中的百分比。可以看到与野生型对照组细胞相比，Pbrm1缺陷型B16F10肿瘤细胞中CD45+细胞中M1样巨噬细胞和DC细胞的比例比对照组中的高。
因此，Pbrm1的失活不仅使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性敏感，而且还导致更有利的肿瘤微环境。
17.通过流式细胞仪分析MHCⅠ类分子和PD-L1的表达。
对照组（非靶向gRNA），Arid2，Pbrm1和Brd7缺陷型B16F10细胞用不同剂量（0,0.1,0.5,1,5或10ng/ml）的IFNγ处理24小时，一式三份。然后用抗H2-Kb或抗PD-L1抗体对细胞进行染色，然后进行FACS分析。BD LSRFortessa X-20用于数据采集，FlowJo（Tree Star）用于数据分析。使用FlowJo计算几何平均荧光强度（gMFI）。
IFNγ的作用：增强MHCⅠ类分子的表达
MHCⅠ类分子：由一条MHCI类基因编码的重链(α链)和一条非MHCI类基因编码的轻链(β2微球蛋白)通过二硫键形成的异源二聚体分子。H2-Kb是经典的MHCⅠ类分子家族成员，能与内源性的抗原肽一起被抗原提呈细胞（APC）提成给CD8+T细胞。
结果显示，与对照组细胞相比，在一定浓度的IFNγ下，Arid2缺陷的B16F10肿瘤细胞中H2-Kb的表达显著增强，而在三个突变细胞系都显示出应答IFNγ的PD-L１表位水平增加。这可能是由于细胞系中还保留有部分活性的复合物。
