做WB最容易翻车的，其实不是电泳和转膜，而是最前面的样品处理和蛋白提取。前面一旦乱，后面全白干。
这篇给你整理成一套清晰可复现流程👇
🧊① 组织预处理（关键：洗干净+降解控制）
✔ 用预冷生理盐水将切碎组织
👉 漂洗 2–3 次（去血液/杂质/干扰蛋白）
✔ 用洁净吸水纸轻轻吸干
👉 去掉多余液体，避免稀释裂解液
💡核心目的：
👉 降低背景 + 防止蛋白提前降解
🧬② 蛋白提取（核心步骤，决定成败）
✔ 按比例加入裂解液
👉 每 20 mg 组织 + 200 μL X-RIPA UltraMix
✔ 钢珠研磨
👉 3–5 min（充分裂解组织）
✔ 冰上静置
👉 10 min（稳定蛋白，减少降解）
💡关键点：
✔ 一定全程尽量低温
✔ 研磨越充分，后面条带越清晰
🧪③ BCA蛋白定量（决定你上样“准不准”）
🧰准备材料
• 96孔板（透明）
• 酶标仪（562 nm）
• 60℃水浴锅
• 移液枪+枪头
📊实验设计
✔ 标准品区 + 样品区提前规划
✔ 标准品建议 3复孔
✔ 样品建议 2复孔
（可以用小程序直接排版，避免出错）
🧫工作液配置
👉 总体积 =（标准孔 + 样品孔 + 1）× 200 μL
👉 A:B = 1:1 混合（得到BCA工作液）
🧪加样流程
✔ 每孔加入 200 μL BCA工作液
✔ 标准品梯度加入：
• 0 / 5 / 10 / 15 / 20 μL
✔ 样品加入：
• 每孔 5 μL
👉 混匀 2–3 次
💡注意：
如果样本珍贵 → 可先用裂解液稀释再测
🔥④ WB上样准备（变性步骤）
✔ X-Loading 与样品 1:4 混匀（5X体系）
✔ 95–100℃ 加热 5 min
✔ 瞬时离心后上样
💡目的：
👉 让蛋白线性展开，保证跑胶一致性
⚡⑤ 电泳（快速版条件）
🧪缓冲液
✔ 50X Buffer → 稀释到1L
🧬操作
✔ 安装预制胶
✔ 检查加样孔是否整齐
✔ 加 Marker（2–3 μL）
⚡跑胶条件
✔ 300V / 15 min或✔ 250V / 20 min
👉 看到Marker分开就可以停
💡核心逻辑：
不是跑越久越好，是“分开就够”
🧻⑥ 转膜（决定你有没有条带）
🧫膜处理
✔ NC膜：直接平衡
✔ PVDF膜：甲醇活化30s后再平衡
🧪转膜液
✔ 800 mL电泳液 + 200 mL乙醇或✔ Buffer + 乙醇 + dd水补足
🧱组装顺序（重点）
黑 → 海绵 → 滤纸 → 胶 → 膜 → 滤纸 → 海绵 → 红/透明
💡核心：
👉 必须赶走气泡！！
⚡转膜条件
✔ 10–180 kDa → 400 mA / 15 min
✔ ＞200 kDa → 400 mA / 20–25 min
✔ ＜20 kDa → 推荐NC膜
🧠总结一句话
👉 WB成功 = 70%在样品处理 + 定量 + 上样
👉 后面电泳转膜只是“执行”
15分钟电泳，15分钟转膜，1个小时完成WB实验，15分钟内参显色
