一、测序流程
- 制备片段化或者双末端DNA文库；
- 乳液PCR/微珠富集；
- Beads loading 到芯片上；
- 连接酶测序：SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。连接反应中，这些探针按照碱基互补原则与单链DNA模板链配对。这样经过五轮测序反应后便可以得到所有的碱基序列。
- SOLiD采用双碱基编码矩阵。
二、SOLiD片段文库
- P1、P2文库接头：进行5'末端无磷酸化处理，防止P1与P2接头自连；
- PCR反应中进行切口平移——Nick-translate；之后再进行变性、退火等过程；
- Platinum® Pfx DNA Polymerase具有3' to 5' 外切酶活性和5' to 3' 聚合酶活性。
三、SOLiD末端配对文库
- 连接Internal adapters，再进行环化，其他分子通过线性酶切消化；
- Internal接头上有限制性酶切位点，切出接头两侧各27nt的跨度，只捕获含Internal接头的序列，之后再连接P1和P2接头，再进行Nick-translate.；Internal接头两侧25nt的序列即是目标测序序列（PE25）。
- 获取常见的pair end信息；
- 获取更长的read信息：
1.正常打断几kb~10几kb；
2.末端修复连接Internal接头（含有生物素标记信息），接头两侧各有一个Nick——可在T7酶和S1酶作用下进行平移和单链消化；
3.可通过控制温度和时间控制缺口的长度，可获得更长的文库序列。
四、文库模板结构
- Fragment Library：3'5'读长50bp；5'3'读长25bp（效率和准确性更低）；
- Mate-Paired Library：中间有Internal接头，两侧读长可达50bp甚至更长，Mate pair tag比对回基因组的位置更长；
- Barcoded Fragment Library：Barcode在P2接头引入，用以区分样本，提高测序通量。
五、乳液PCR——“一液滴，一磁珠，一模板”
- 通过乳液PCR使模板在磁珠上扩增形成单克隆的DNA分子簇，并通过分子杂交和差速离心的方法对模板磁珠进行收集，经过修饰之后固定在flow cell上进行测序。
六、ABI SOLiD连接测序原理
- 探针含有8个碱基，探针的5'末端标记了1种颜色的荧光染料。探针3’端1 ~ 5位为随机碱基，其中第1、2位构成的碱基对表征探针染料类型，而3 ~ 5位的“n”为随机碱基，6 ~ 8位的“z”是可以和任何碱基对配对的特殊碱基。SOLiD测序反应的每一轮测序都会连接第1 ~ 5位的碱基，同时切除第6 ~ 8位碱基，同时记录下第1~2位碱基决定的荧光颜色。
- 一轮反应后只有探针上5个碱基连接到目标序列上，下一轮测序即是6 ~ 7号位的碱基信息。每轮测序有3个碱基的gap。
- 第六轮后加入新的测序引物（长度相对前5轮的引物长度为n-1个碱基），这样与前面一轮大循环（5轮反应）有一个碱基的错位，相当于一个碱基测了两次。
- 可通过单色荧光或者双色荧光信号改变来确定是SNP或者Sequencing error。
