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关于DNA-EMSA的前生今世

ps：老司机可以直接跳到下一板块

用途：研究蛋白和DNA的特殊结合序列（比如转录因子和启动子的特异结合，再比如这个漫画）

原理：结合蛋白的DNA由于分子量变大，在电泳时跑的慢，那么如何检测这个互作复合物？可以在DNA上加一面旗子，这面旗子可以是放射性同位素，可以是地高辛，也可以是生物素。

实验流程：

图.采用生物素检测系统的DNA-EMSA实验流程

如何证明结合特异性：对照实验。怎么设置对照呢？举个例子就妥妥清楚了。

图中人物介绍

核蛋白提取物

三种DNA探针

特异结合的标记探针—与核蛋白紧密结合；

特异结合的未标记探针—与标记探针竞争结合，俗称冷探针；

无关未标记探针---“打酱油”DNA，不与核蛋白结合。

第一泳道—只有特异结合的标记DNA，放荡不羁爱自由-跑到了最前面

第二泳道---在第一道基础上，加了核蛋白提取物，出现了“情侣拥抱”条带，俗称shift条带

第三泳道—在第二道基础上，加入过量捣乱DNA（竞争冷探针），它抢走大量目标蛋白，由于没带标记，“情侣拥抱”条带变淡，甚至消失

第四泳道—加入无关未标记探针，坐视不理核蛋白抽提物，结合条带再次出现

这证明了什么？（记几想。想不通找小编。）

关于DNA-EMSA常见问题

之基础篇

1）需要准备哪些材料，就可以开始DNA-EMSA了？

核蛋白提取物，标记探针，未标记探针，未标记无关探针，非变性电泳凝胶，尼龙膜，检测系统

2）如果要开始实验，我还需要考虑哪些点？

可以从检测体系、结合蛋白、探针标记、电泳转膜这几个方面优先入手。（下方将逐项展开）

检测体系

三种检测系统：放射性同位素、地高辛、生物素有何区别，选择哪种比较好？

检测灵敏度：放射性同位素≈生物素＞地高辛

安全性：生物素≈地高辛＞放射性同位素

至于选择哪种，还要综合考虑实验室情况和使用习惯。

结合蛋白篇

我的蛋白丰度低，能做出实验来吗？

实验体系的灵敏度够，理论上是可以的。建议富集靶标区域蛋白，比如专门富集核蛋白（DNA主要在细胞核内发生调控）实验结果会更明显

蛋白添加量多少比较好？

Thermo Scientific生物素系统EMSA，建议蛋白添加量2-5ug。

核蛋白浓度较低，上样前如何定量？

建议使用microBCA（检测范围0.5-20ug/mL），低浓度定量更准确。

探针标记篇

探针如何标记（直接合成还是自己标记）？

建议11-30bp的DNA探针可直接合成标记生物素，价格合适。碱基长度过长的DNA探针建议采用试剂盒进行标记，更划算。

由于DNA探针生物素标记采用TdT末端转移酶，此酶单链标记效率更高，可将DNA双链热变性，标记后退火即可。核酸互补链的退火方法有很多，参见技术贴士45：“寡核苷酸互补对的退火”，有详细的操作步骤。

如何检探针的标记效率？

斑点杂交。#89818说明书中有详细protocol可供参考。

探针长度有限制吗？

通常EMSA实验的DNA长度为20-35bp，我们成功检测过60bp长度的DNA。实际上蛋白与DNA binding的长度为10-15bp，如果binding的序列未知或者有多个调控区域，也可尝试更长的探针，但是长探针也会增加非特异性结合的风险。

电泳转膜篇

使用琼脂糖胶，还是必须用聚丙烯酰胺胶？

这两种胶都可以用在EMSA实验上，具体采用那种，要看实验对分辨率的需求。传统上使用4%-6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，毛细管转印或者电转都可以。如果使用琼脂糖凝胶，毛细管转印更推荐。

为何要预电泳？

上样前，建议聚丙烯酰胺凝胶通电预跑30-60min，除掉胶中影响互作的杂质。

选用哪种膜？

正电尼龙膜。