5.2 数据可视化与降维
5.2.1 简介
在本章中，我们将继续使用上一章生成的过滤后的Tung数据集。我们将探索可视化数据的不同方式，以便评估质控步骤后表达矩阵发生的变化。scater包提供了几个非常有用的函数来简化可视化。
单细胞RNA测序的一个重要方面是消除批次效应。批次效应是在处理过程中添加到样本中的技术噪音。例如，如果两组样品是在不同的实验室中准备的、甚至在同一实验室的不同日期准备的，那么我们可能会观察到同时处理的样品之间有更大的相似性。在最坏的情况下，批次效应可能会被误认为是真正的生物变异。Tung的数据使我们能够以可控的方式探索这些问题，因为样本处理方式的一些突出的方面已被记录下来。理想情况下，我们希望看到来自同一个体的批次聚集在一起，并且每个个体对应不同的组。<
让我们创建另一个SingleCellExperiment对象umi.qc，删除不必要的低表达基因和低质量的细胞。
> umi.qc <- umi[! rowData(umi)$discard,! colData(umi)$discard]
5.2.2 PCA作图
全览数据的最简单方法是使用主成分分析对其进行转换，然后可视化前两个主成分。
主成分分析（PCA）是一种统计过程，它将一组观测值转换为一组线性不相关（正交）的变量，称为主成分（PC）。主成分的数量小于或等于原始变量的数量。
从数学上来说，PC对应于协方差矩阵的特征向量。特征向量按特征值排序，以便第一个主成分尽可能多地解释数据中的变异性，并且每个后续PC在与前一个PC正交的前提下依次具有最高的方差。<
5.2.2.1 QC前
如果没有进行对数变换或标准化，PCA图就无法按重复或个体分离数据集。测序深度具有重要影响——具有大量高表达基因的样本（细胞）主导着PC：
> umi <- runPCA(umi, exprs_values = "counts")
> dim(reducedDim(umi, "PCA"))
[1] 864 50
> plotPCA(umi, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")
通过对数变换，我们均衡了高表达和低表达基因之间的巨大差异，并看到细胞按重复、个体和测序深度分组。当重新运行PCA时，umi中的reducedDim对象将被覆盖。
> umi <- runPCA(umi, exprs_values = "logcounts_raw")
> dim(reducedDim(umi, "PCA"))
[1] 864 50
> plotPCA(umi, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")
显然，对数变换对我们的数据是有益的——它减少了第一个主成分的方差并且分离了一些生物学效应。此外，它使表达值的分布更加正常。在以下分析和章节中，将默认使用logcounts_raw。
但是，仅进行对数转换不足以解释细胞之间的技术误差（例如测序深度）。因此，请不要使用logcounts_raw进行下游分析，而是使用SingleCellExperiment对象的logcounts，它不仅进行了对数转换，还按文库大小进行了归一化（例如CPM归一化）。在课程中，我们仅将logcounts_raw用于演示目的。
5.2.2.2 QC后
使用umi.qc数据而不是umi进行与上述相同的分析：
> umi.qc <- runPCA(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw")
> dim(reducedDim(umi.qc, "PCA"))
[1] 670 50
> plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")
与上图相比，经过QC后，NA19098.r2（橙色圆）细胞不再形成异常值组。
默认情况下，scater仅使用变异最大的前500个基因来计算PCA，可以通过ntop参数来调整。
5.2.3 tSNE图
用于可视化scRNA-seq数据的替代方法是tSNE图。tSNE（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding）将降维结果（例如PCA）与最近邻网络上的随机游走相结合来将高维数据（即示例的14,154维表达矩阵）映射到二维空间，同时保留细胞之间的局部距离。与PCA相比，tSNE是一种随机算法，这意味着在同一数据集上多次运行该方法将产生不同的结果。由于算法的非线性和随机性，tSNE难以直观地解释。为了确保可重复性，我们在以下代码中指定了随机数生成器的“种子”，以便我们始终获得相同的结果。
5.2.3.1 QC前
> set.seed(123456)
> umi <- runTSNE(umi, exprs_values = "logcounts_raw", perplexity = 130)
> plotTSNE(umi, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")
5.2.3.2 QC后
> set.seed(123456)
> umi.qc <- runTSNE(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw", perplexity = 130)
> plotTSNE(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")
解释PCA和tSNE图通常具有挑战性，并且由于随机性和非线性性质，它们不太直观。在这个例子中，很明显它们产生了类似的图像。对比上面的PCA图，再次清楚地表明，经过QC过滤后NA19098.r2样本不再是异常值。
此外，tSNE要求提供一个困惑度（perplexity）参数，该参数反映了用于构建最近邻网络的最近邻数量，高困惑度会创建一个密集的网络，使细胞聚集在一起，而低困惑度会使网络变得更加稀疏，从而使细胞群彼此分离。scater使用默认的困惑度，即总细胞数除以五（向下取整）。
可以在http://distill.pub/2016/misread-tsne/阅读有关使用tSNE的更多信息。最近的一篇题为《The art of using t-SNE for single-cell transcriptomics》的文章讨论了tSNE和UMAP之间的异同，文章发现大多数观察到的差异是由于初始化造成的，并在可视化不同大小的scRNA-seq数据集时给出了参数调整的建议。
往期内容：
重生之我在剑桥大学学习单细胞RNA-seq分析——4. 使用Bioconductor进行scRNA-seq分析（1）
重生之我在剑桥大学学习单细胞RNA-seq分析——4. 使用Bioconductor进行scRNA-seq分析（2）
重生之我在剑桥大学学习单细胞RNA-seq分析——5. scRNA-seq数据的基本质量控制 (QC) 和探索（1）
