大家好，今天给大家介绍一篇最近发表在Journal of Advanced Research （中科院一区，影响因子10.7）上的公共数据生信分析结合实验验证的文章，标题为“Integrative analysis of senescence-related genes identifies robust prognostic clusters with distinct features in hepatocellular carcinoma”。作者利用公共数据，基于衰老相关基因揭示了不同衰老模式下肝细胞癌患者的预后、基因突变、免疫微环境差异，构建衰老评分系统评估不同情况下肝细胞癌的衰老，筛选针对不同分群病人的治疗药物，最后提出了一种新的筛选marker基因的方法Signature-related gene analysis（SRGA），并对衰老标记基因进行了实验验证。
本文属于单肿瘤基因集分型思路，衰老相关基因生信分析也有大量文章发表，在如今公共数据生信分析越来越卷的情况下，能发表在10+以上的文章实属不易。如何打破常规生信套路，为文章添加创新点，吸引编辑和审稿人的眼球？通过解读该文章，希望对大家有所帮助。
摘要
介绍：衰老是指一种永久性细胞生长停滞的状态，被认为是一种肿瘤抑制机制，而越来越多的证据表明，衰老细胞在癌症进展中起着不利作用。缺乏反映癌症衰老水平的特异性和可靠的标志物阻碍了我们对这一生物学基础的理解。
目标：收集衰老相关基因(SRGs)进行综合分析，以揭示衰老在肝细胞癌(HCC)中的作用。
方法：基于SRGs，采用共识聚类对HCC进行分型。采用ssGSEA、模糊c均值算法等计算方法进行分析。利用药物敏感性数据筛选不同衰老患者的潜在治疗药物。此外，我们开发了一种称为Signature-related gene analysis (SRGA)的方法，用于鉴定与感兴趣表型相关的标记。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、β-半乳糖苷酶(β-半乳糖苷酶)测定、western blot和肿瘤-t细胞共培养系统等实验策略在体外验证研究结果。
结果：我们确定了三个预后不同的HCC患者群，它们具有不同的生存结局、突变景观和免疫特征。我们进一步提取衰老集群的特征基因，构建衰老评分系统，并在bulk和单细胞分辨率下描绘HCC的衰老水平。衰老诱导的干细胞重编程在生信分析和体外实验中均得到证实。高度衰老的HCC患者免疫抑制，对Tozasertib等药物敏感。我们认为MAFG、PLIN3和其他4个基因与HCC衰老有关，并且MAFG可能介导免疫抑制、衰老和干性。
结论：我们的研究结果为SRGs在患者分群和精准医疗中的作用提供了见解。
相关数据集选择
衰老相关基因的筛选：从AgingAtlas、Human Ageing Genomic Resources、KEGG、Reactome中获取共368个SRGs
| 数据集 | 测序类型 | 样本类型 |
|---|---|---|
| TCGA-LIHC | Bulk RNA-seq | 肝癌患者 |
| ICGC-LIRI | Bulk RNA-seq | 肝癌患者 |
| GSE14520 | Bulk RNA-seq | 肝癌患者 |
| GSE54236 | Bulk RNA-seq | 肝癌患者 |
| GSE125449 | scRNA-seq | 肝癌患者 |
| IMvigor210 | Bulk RNA-seq | 尿路上皮癌免疫治疗 |
| GSE78220 | Bulk RNA-seq | 黑色素瘤免疫治疗 |
| GSE155182 | scRNA-seq | 衰老小鼠肝 |
研究结果
基于衰老相关基因鉴定出三种HCC分群
图A展示作者在4个公共数据集中共获得368个衰老相关基因（SRGs），图B中利用共识聚类表明SRGs可以将HCC患者分成三种亚型。图C和D显示，从ClusterA到ClusterC，衰老相关通路和标志基因如GLB1、TP53、CDKN1A、CDKN2A等逐渐升高，表明ClusterC反应高衰老的状态。而多个数据集的生存分析表明，ClusterC的患者预后最差（图E-H）。
三种HCC分群的基因突变情况
作者展示了top 10高频突变基因在三种HCC分群中的情况，其中ClusterC的患者TP53突变频率较高，CTNNB1突变频率相较于其他分群患者低（图A和B）。图C展示了基因突变的共现事件和互斥事件。在ClusterA中，TTN与AHNAK2、MUC16与RYR2、RYR3与USH2A共突变显著。ClusterB的共突变事件相对高于其他2个分群，其中CTNNB1与APOB、OBSCN与FLG、DNAH7与PCLO显著。ClusterC中TP53与PCLO、RYR1与ADGRV1、ABCA13与PCLO存在显著共突变。在图D中，作者利用GISTIC2检测不同分群中异常的CNV区域。所有分群的染色体8q24都存在扩增，染色体1p36和8p23上存在缺失。而在ClusterB的6号染色体上有特异性扩增。在ClusterC的3号染色体上有一个独特的缺失（图D）。
衰老分群的免疫图谱
图A中，作者展示了不同的免疫检查点分子在3种HCC分群中的表达情况，发现在ClusterC中表达水平最高。ESTIMATE分析表明，ClusterC具有更高的免疫、基质以及ESIMATE得分（图B）。随后作者采用ssGSEA方法进行免疫细胞浸润分析，发现T细胞，包括自然杀伤T细胞、T滤泡辅助细胞和调节性T细胞在ClusterC中较高，而中性粒细胞在ClusterA中占比更高（图C）。在图D-F中，作者分析了3种HCC分群中免疫衰竭、免疫抑制和免疫排斥的得分情况，发现免疫逃避或抑制相关的特征，如调节性T细胞、髓源性抑制细胞和癌症相关成纤维细胞，以及EMT、WNT和TGFb信号通路的激活在ClusterC中最为富集。
提取衰老标记基因并量化衰老
作者采用Fuzzy c-means（R包Mfuzz）在两个数据集LIHC和LIRI中进行了基因集群分析（图A-B），发现从ClusterA到ClusterC中，有一群基因的表达水平持续升高，可能与衰老状态的变化有关。图C中作者对两个基因集群取交集，获得了100个基因，将其命名为Sene.marker。作者采用富集分析发现这些基因参与了细胞衰老和细胞对刺激反应的几个通路，可能是OIS（癌基因诱导衰老）和TIS（治疗诱导衰老）的潜在触发因素。进一步分析表明，这些基因的平均表达水平与多个衰老标志物的表达水平具有正相关（图D）。利用Sene.marker的平均表达水平，按照中位值将样本分成高、低两组，一致性聚类的ClusterA病人大多数属于低组，而ClusterC的病人则多数属于高组。利用GSEA方法，作者表明多个衰老基因集在高组病人中显著激活（图E）。这些结果为量化HCC的衰老提供了依据。
衰老和干性的相关性分析
前期的多项研究表明，衰老的肿瘤细胞具有较强的干性，并可能重新进入细胞周期。为了进一步证明该发现，作者首先利用ssGSEA计算了样本中干性相关特征的富集情况。结果表明ClusterC或者是Sene.High的病人，干性得分相对其他病人更高（图A、B）。相关性分析表明Sene.marker和多个干性或者衰老的标志基因具有正相关（图C）。作者进一步用阿霉素处理肝细胞癌细胞系Huh7来构建治疗诱导衰老（TIS）模型（图D-E），测序数据和体外实验结果都表明HCC发生衰老后，干性相关基因如EPCAM、KRT19、ANXA3、KLF4等表达升高（图F-G）。这些发现证实了HCC在药物治疗后发生干性重编程且衰老相关。
利用Sene.marker预测潜在的抗衰老药物和免疫治疗效果
为了进一步了解衰老分群的临床应用，作者评估了药物敏感性与Sene.marker之间的关系。在LIHC患者中。作者共发现82种药物与Sene.marker呈负相关，这些药物被认为是敏感药物，而只有3种药物呈正相关（图A)。其中有较多靶向有丝分裂、细胞凋亡调控和PI3K/MTOR通路的药物，为开发治疗肿瘤衰老的药物提供了新的思路（图B）。化疗药物SB505124 （Rs = 0.64）、AZD2014 （Rs = 0.43）和Selumetinib （Rs = 0.40）对Sene.marker表现出耐药性，可能是治疗ClusterA患者的合适方法（图C-E）。另一方面，Tozasertib （Rs = -0.81）、Osimertinib （Rs = -0.77）和UMI-77 （Rs = -0.75）对Sene.marker最敏感，表明它们可能是ClusterC的抗衰老药物（图F-H）。总之，这些结果为不同的衰老群体提供了量身定制的治疗策略。作者还利用两个免疫治疗队列验证了Sene.marker预测患者免疫治疗反应的效果。结果表明，Sene.High的患者，免疫治疗后总生存期延长（IMvigor210, p = 0.018;GSE78220, p = 0.037，图I, L）。这可以解释为肿瘤衰老过程中表达的免疫检查点分子水平较高，以及存在免疫抑制细胞的富集（图3）。这些特征与免疫治疗应答增强相关，并可确保患者从免疫系统的再激活中获益。此外，在IMvigor210中，Sene.High的患者肿瘤突变负荷和新抗原负荷明显更高（图J-K），其编码的异常蛋白可被免疫细胞识别和消灭。因此，衰老评分较高的患者可能从免疫治疗中收益。
SRGA有助于鉴定新的衰老相关基因
为了鉴定与衰老特征相关的候选基因，作者开发了一个名为SRGA的R包（图A）。SRGA整合并修改了ImmLnc和GSEA的框架，利用bulk转录组数据和先验的生物学知识来鉴定与感兴趣的表型（如免疫、衰老，或者可以扩展到癌症转移和耐药）相关的新标记基因。作者通过差异表达分析提取了3个HCC衰老分群的2244个标记基因，使用AgingAtlas中的12条通路以及预先定义的Sene.marker作为输入，采用SRGA对每个特征通路以及每个基因进行评分（图B）。前5个特征基因对网络显示，UBD、SPINK1、CENPU和HLA-DRA分别与两个不同的特征通路显著相关（图C）。作者根据衰老特征的计算得分对基因进行排名（图D），结合Cox和Kaplan-Meier，选择MAFG、TUBA1C、CSTF2、PLIN3、FAM83D、MMP12这6个基因作为与患者生存相关的新衰老相关基因。
新衰老相关基因的验证
公共数据分析表明，新的衰老相关基因的表达从ClusterA到ClusterC，以及从Sene.Low到Sene.High出现升高，表明这6个基因是潜在的候选基因。为了验证这些结果，作者使用阿霉素处理Huh7细胞构建衰老模型。不同浓度的阿霉素处理Huh7 4天或用50 nM浓度处理不同时间，细胞表现出明显的衰老，包括形态学的变大和扁平（图A）， SA-β-Gal染色增强（图B）， p21和p53蛋白表达增加（图C）。此外，当Huh7衰老时，MAFG和PLIN3的蛋白表达升高（图C）。与此一致的是，新发现的衰老相关基因的mRNA表达在剂量和时间依赖的模型中也有所增加（图D-E）。这些数据表明，SRGA可以用来鉴定新的表型相关的基因。
MAFG在HCC中调控衰老相关表型
作者进一步探索衰老背后的潜在机制。由于MAFG是转录因子，并且得分排名最高，作者后续研究中重点关注该基因。在衰老模型中，敲除MAFG会减弱一些衰老特性，导致衰老标志物mRNA和蛋白质水平的表达减少（图A-B）， SA-β-Gal染色减少（图C）。当Huh7衰老时，PD-L1的表达增加，这可以通过敲除MAFG来缓解（图D）。此外，作者鉴定了2017个启动子区域包含潜在MAFG结合位点的基因，这些基因包括干细胞标志物PROM1和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN1C和CDKN2C。作者还观察到在LIHC数据集中，MAFG与PD-L1 (Rs = 0.2, p = 8e-05)、PROM1 (Rs = 0.26, p = 4.8e-07)和CDKN2C (Rs = 0.36, p = 1.3e-12)呈正相关。公共的MAFG ChIP-seq数据显示，MAFG在这些基因的几个区域中富集。因此，MAFG可能在衰老诱导的干细胞和免疫重编程中发挥重要作用。
作者采用活化T细胞和肿瘤细胞共培养实验进一步证实MAFG的免疫调节作用（图E），观察到衰老的Huh7细胞比未衰老的Huh7细胞对T细胞更敏感。在衰老细胞中敲低MAFG会显著增加T细胞的细胞毒性（图F）。进一步分析小鼠肝脏内皮细胞的scRNA-seq数据表明，在tom-（非衰老）和tom+（衰老）细胞中，Mafg的表达也有区别。根据其表达情况将衰老细胞分为Mafg+和Mafg-，其中Cd274转录本在Mafg+衰老细胞中更频繁地表达（图G）。GSEA结果显示，Mafg+衰老细胞中稳态、表皮细胞发育和分化相关通路的激活增加，而Mafg-衰老细胞中抗原加工和呈递相关通路的激活增加（图H）。因此，Mafg-衰老细胞更容易被免疫细胞识别和清除。
研究总结
这篇文章关注衰老相关基因在肝细胞癌中的作用，通过对公共数据的bulk RNA-seq进行分型分析，发现存在3个衰老相关亚型，其中ClusterC的衰老程度相对最高，预后更差。进一步分析揭示了不同衰老亚型的突变情况和免疫浸润差异。以上分析皆为生信常规套路，创新点在于利用基因表达聚类分析筛选出包含100个基因的Sene.marker，其平均表达水平可作为反应HCC衰老的指标，为系统性评估HCC衰老提供初步的依据。进一步利用生信分析、体外实验证实了衰老引起的干性增加，同时免疫检查点相关基因如PD-L1表达升高，呈现出免疫抑制的微环境。有趣的是，作者提出SRGA算法（https://github.com/LucasLiu20200131/SRGA）用来筛选新的表型相关基因，该方法可以扩展延伸用在其他肿瘤表型中，利用如免疫、转移、自噬、凋亡相关的基因集，筛选与感兴趣的表型相关的新基因，后续可以用在自己的课题中，结合实验进一步验证。最后，对筛选得到的MAFG做了一系列生信分析和体外实验验证，表明其潜在参与调控HCC的衰老、干性以及免疫逃逸。在Huh7细胞中敲低MAFG，其对T细胞的杀伤能敏感。这项研究将肝细胞癌的精准治疗提供一个新的潜在靶点。
Reference
S. Liu, Y. Meng, Y. Zhang et al., Integrative analysis of senescence-related genes identifies robust prognostic clusters with distinct features in hepatocellular carcinoma, Journal of Advanced Research, https://doi.org/10.1016/j.jare.2024.04.007
