影响因子：9.7

研究概述：DNA损伤修复（DDR）在肝细胞癌（HCC）中发挥着关键作用，推动着肿瘤的发生、发展和治疗反应。然而，DDR介导的免疫细胞和免疫调节途径在HCC中的作用机制尚不明确。作者利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和bulk RNA-seq数据，引入了一种创新的深度机器学习框架，用于精确评估DDR。作者获得了单细胞RNA测序数据，共分析了85628个原发性或免疫治疗后病例的细胞。大规模HCC数据集（包括1027名患者的内部数据集和公共数据集）被用于101个机器学习模型，并在单细胞分辨率（DDRscore）上得出了新的DDR特征。利用169名HCC患者的反相蛋白质阵列（RPPA）蛋白质组图谱和22种肝癌细胞系的RNA-seq数据，预先推测了可用药靶点。研究的示意图见图1A。

研究结果：

HCC恶性细胞的DDR异质性分析

为了揭示哪些细胞区对患者间的异质性贡献最大，作者使用标记基因对每个细胞群进行了注释和分区。HCC生态系统的组成主要由肝细胞和B细胞（BCs）等构成（图1B）。为了进一步了解瘤内异质性，作者比较了单个样本水平的细胞区的内容（图1C）。作者应用CopyKAT算法从9个肿瘤样本中提取了9957个恶性细胞，并作进一步分析（图1D）。观察到的瘤间异质性突显了恶性细胞因原发样本而存在的生物学差异（图1E左侧面板）。此外，不同样本中已确定的恶性细胞群的频率也各不相同，树枝图显示，这些恶性细胞群基本上根据病理阶段形成了聚类（图1E右图）。为了量化恶性细胞的DDR状态，作者首先对9957个恶性细胞的单细胞表达谱进行了高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA），以提取与致癌转化相关的基因。接下来，作者从所有已识别模块中选出了3230个与TNM分期显著相关的基因，作为肿瘤进展的关键指标（图1F）。其中，56个基因已知参与了DDR过程（图1G）。

作者开发了一个参数化评分系统（DDRscore），可根据恶性细胞定量评估DDR状态，通过此系统作者发现与晚期HCC相比，早期HCC的DNA损伤修复活性水平明显更高（图1H），这支持了之前的假设。利用恶性细胞的DDR评分得出HCC样本的总体DDR水平，DDR水平大于0的样本被定义为"DDR-高"组，而DDR水平小于0的样本被定义为"DDR-低"组（图1I）。在这种分组分配下，作者根据基因富集分析比较了相关通路以区分这些肿瘤细胞，结果发现了抗肿瘤的p53和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）通路在低DDR组中上调，而亲肿瘤的表皮生长因子受体（EGFR）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）通路在高DDR组中上调，这验证了作者的DDR评分分类（图1J）。综上所述，这些结果表明，恶性细胞的DDR在肿瘤间具有显著的异质性，可能会导致肿瘤进展。

不同DDR条件下HCCTME生态系统的不同特征

在阐明DDR驱动的致瘤性改变后，作者继续从TME角度探索HCC样本的差异。作者以单细胞分辨率生成了DDR-high和DDR-low TME（图2A），然后应用基于OR的统计分析来评估潜在的细胞类型改变。作者发现，NK细胞与“低DDR”组的联系最强，而B细胞似乎在“高DDR”组中富集最多（图2B）。通过关注NKs子种群，作者生成了一个自由分类，然后作者进一步解剖了这些异源细胞群的细节。对于NK细胞，单细胞表达谱（包括DDR-高和DDR-低肿瘤）在各种分辨率下进行聚类，随后构建分类树。结果表明该树中有一个稳定的区域（图2C）。NKs聚集成六个亚群:SPP1+NKs、LDLRAD4+NKs、GSTA1+NKs、IGLC3+NKs、IRF8+NKs和FCGR3A+NKs（图2D–E）。在这些NK亚群中，大多数（78%）属于“低DDR”组，这些亚群主要包含SPP1+NKs、LDLRAD4+NKs、IRF8+NKs和FCGR3A+NKs。相反，“DDR-高”组以GSTA1+NK和IGLC3+NK为主（图2F）。

对于B细胞，作者还将其分为CD20+B细胞和CD138+浆细胞(图2G下图)。值得注意的是，CD20+B细胞在“DDR-低”组比“DDR-高”组更常见(图2G，上图)。通路分析表明，CD20+在“DDR-高”患者中激活了“PPAR信号通路”，而在“DDR-低”患者中激活了“胞浆DNA传感通路”，即cGAS-STING通路。对于CD138+浆细胞，“DDR-High”组的“B细胞受体信号转导”活性也升高，而“DDR-low”组的“糖酵解糖异生”增强(图2H-K)。

免疫检查点阻断后高DDR介导的免疫抑制特点

为了揭示导致免疫疗法引起的生物差异的关键细胞成分，作者首先使用“TransferData”算法通过引用上述SING细胞数据(GSE149614)推导出的细胞类型来注释细胞类型(图3A)。此外，与非免疫组相比，免疫组的恶性细胞较少，CD8+T细胞较多(图3B)。在确保细胞注释和聚集的稳健性后，作者注意到免疫治疗后总体肝癌肿瘤上皮比率下降，这一发现可能归因于免疫检查点抑制剂诱导的肿瘤杀伤(图3B-C)。与非免疫治疗的肝细胞癌相似，H08、H68和H74都表现出相当大的肿瘤间异质性，相比之下，接受免疫治疗的其他肝癌细胞彼此相对较近(图3D)。接下来，作者使用DDRScore算法来探索这些ICI治疗样本中的DDR状态，在患者水平上，不同的DDR状态形成了不同的TME，一些免疫表型成分发生了变化(图3E)。作者进一步对按DDR状态分层的恶性细胞群体进行了差异和功能分析。作者观察到“DDR-LOW”组激活了脂肪酸代谢途径、WNT途径和可能的致癌MYC激活(图3F-G)。相反，“DDR-HIGH”组表现为上皮-间充质转化(EMT)，KRAS的致癌激活与上述发现相匹配(图3E)。

接下来，为了探索EMT是如何介导DDR转变的，作者绘制了肿瘤细胞的发展轨迹。伪时间推断了一种从恶性细胞团开始并逐渐分化为成纤维细胞的发展趋势，这表明在DDR适应条件下纤维化TME的形成可能起到了作用(图3H)。最后，作者调查了不同DDR评分患者的免疫细胞成分，特别是LAG-3在“DDR-LOW”患者的CD8+T细胞中的表达显著升高(图3I)。此外，通过测量MHC分子，作者发现MHCI分子HLAA、B、C(经典)和HLA-E、F、G(非经典)显示出增加的伴侣，类似地，细胞类型特异性MHCII分子(仅限于B细胞、DC和巨噬细胞介导)在“DDR-LOW”患者中同时上调(图3I)。综上所述，这些现象表明，以DDR分数为特征的DDR状态在TME中对区分接受ICI免疫治疗的肝癌患者具有一定的调节作用。

共同中心基因的选择和验证

作者接下来使用了多种生物信息学工具（CellPhoneDB、NicheNet和scMLnet）来识别ICI治疗患者不同DDR状态下特定细胞类型中配体-受体对之间的分子相互作用。在整体范围来看，TME细胞-细胞间的通讯发生了动态重编程，其中"DDR-高"通过成纤维细胞-内皮细胞轴集中，而"DDR-低"则完全转向以巨噬细胞为主的模式（图4A-B）。在DDR低的组中，与巨噬细胞、DC和NK细胞的交流分别增加（图4B-C）。除了CD8+T细胞自身相互作用产生的通讯外，与内皮细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞的相互作用现象也较少（图4B-C）。从配体表达水平来看，利用NicheNet算法，作者确定了与不同DDR水平相关的主要配体表达（图4D）作者使用CellphoneDB进一步研究了它们潜在的互作分子（图4E）。

通过生成一个完整的"配体-受体-转录因子-靶基因"网络，进一步研究了这一"DCs-CD8+T细胞"相互作用轴，并预测了"DDR-低"组中可能受调控的多种免疫相关通路。这一相互作用网络不仅证实了之前发现的通过HLA-B、HLA-F/E和B2M等MHC呈递的交叉对话，还证实了可能通过PD1/PD-L1通路桥接的致癌MYC基因激活（图4F）。有趣的是，CXCL10-CXCR3轴的一个重要靶基因IFNG可通过GATA3、REL和TBX21等转录因子调控，这揭示了CXCL10-CXCR3轴在低DDR状态下招募DC和CD8+T细胞与CD8+T细胞相互作用并介导CD8+T细胞浸润肿瘤龛中的关键作用（图4F）。为此，作者的研究结果在使用生物信息学工具进行深入分析的支持下，描述了免疫治疗后以DDR状态为特征的HCCTME的动态变化（图4G），从而探索了未来可能的治疗策略。

DDR共识特征可预测HCC预后和免疫疗法反应性

为了进一步利用上述转录特征，作者提取了通过单细胞RNA-seq鉴定出的56个重要DDR基因，并开发了一种基于机器学习的整合技术，利用外部大量RNA-seq数据集生成DDRscores。作者利用LOOCV框架拟合了101种组合式机器学习方法，并将TCGA-LIHC队列作为训练数据集，将ICGC-LIRI-JP队列作为验证数据集。作者计算了每个模型的C指数（图5A）。由此，作者得出了平均C指数为0.843的最佳预测模型（Lasso+随机生存森林，RSF）（图5A，右面板条形图）。

当部分似然偏差达到最小值时，使用LOOCV框架确定了最佳λ（图5B，左侧面板）。在此截断条件下，使用非零Lasso系数的RSF分析最终确定了17个DDR基因的重要性（图5B，右图）。然后利用RSF模型中17个DDR基因的回归系数加权表达确定了每位患者的DDR评分，随后将患者分为"DDR高"或"DDR低"组。作者发现在TCGA-LIHC和ICGC-LIRI-JP数据集中，"DDR高"患者的总生存期（OS）明显低于"DDR低"患者（图5C-D）。根据上述结论，基于所选17个基因建立的模型显示，与"DDR低"组相比，"DDR低"组患者的OS和无复发生存率（RFS）均有所改善（图5E-F）。

使用秩和检验进行的进一步分析也证明，在所有三个独立队列中，"DDR-低"HCC患者的生存获益（图5G-I）。至此，这些结果证实了通过定量DDR状态评估生成的稳健模型，该模型可能是预测HCC患者获益的潜在预后指标。作者还利用亚类图谱将已确定的DDRscore组的表达模式与另一个已发表的包含47例免疫治疗反应性黑色素瘤患者的数据集的表达模式进行了对比。使用TIDE算法模型，所有三个独立队列都显示低DDRscore与PD-1反应之间可能存在关联，而高DDRscore则倾向于PD-1无效（图5J）。最后，通过使用独立队列，作者发现高DDRscore与疾病进展相关（图5K）。综上所述，作者的研究结果表明，DDRscore的额外值可能与免疫疗法的疗效有关，这一发现也得到了上述单细胞分析的证实。

通过抑制B-Raf通路以靶向高DDR评分的HCC患者

为了确定与DDR状态相关的潜在治疗靶点，尤其是那些DDR评分高、临床疗效可能较差的患者，作者首先计算了22种HCC细胞系的DDR评分（图6A）。然后，作者从TCGA-LIHC队列中检索了反相蛋白阵列（RPPA）数据，并将单个患者的DDR评分与配对的RPPA蛋白质组数据进行了关联，结果发现B-Raf表达与DDRscore呈正相关（图6B）。接下来，作者应用CERES评分评估了基于22个肝癌细胞系的单个基因依赖性与DDR评分之间的相关性，结果再次筛选出BRAF基因是高DDR评分的重要预测因子（图6C）。

利用涵盖384种关键致癌和可药用蛋白及其修饰形式的面板，作者发现B-Raf的活性形式（丝氨酸445处磷酸化的B-Raf）及其下游靶标MARK3和ERK1/2在HCC中显著升高（图6D-E）。同时，作者还发现BRAF在DDR高分组中明显上调（图6F）。这些数据结合了外部TCGA数据和内部RPPA图谱分析，揭示了针对DDR高患者的BRaf通路的潜在治疗弱点，可能对患者分层具有重要的临床意义。

研究总结：

作者的研究揭示了原发性HCC微环境中DDR与自然杀伤细胞和B细胞的动态相互作用，通过新陈代谢程序形成了一种促进肿瘤的免疫环境。对免疫治疗后HCC的分析表明，DDR水平的升高诱导了上皮-间质转化和成纤维细胞样转化，重塑了纤维化肿瘤微环境。相反，减弱的DDR可促进树突状细胞和CD8+T细胞的抗原交叉呈递，从而调节炎症性肿瘤微环境。调控网络分析发现，CXCL10-CXCR3轴是低DDRHCC免疫治疗反应的关键决定因素，可能受转录因子GATA3、REL和TBX21的调控。作者利用机器学习技术，将内部的大量RNA-seq数据与公共数据集结合起来，推出了DDRscore这一稳健的共识DDR评分系统，用于预测HCC患者的总生存期和对PD-1疗法的耐药性。最后，作者确定BRAF为高DDRscore患者的潜在治疗靶点。