影响因子：5.6
期刊： International Immunopharmacology
研究概述：脑出血后，脑实质中充满凝血酶、红细胞成分以及胶质细胞和浸润的外周免疫细胞释放的炎症因子，这些可能会使抗氧化防御系统过载，导致抗氧化剂消耗增加，抗氧化酶活性降低，从而引发氧化应激(OS)损伤。因此，确定与OS相关的基因可以增强对ICH后氧化应激反应的理解。作者采用单细胞RNA测序结果研究脑出血后细胞层面上的OS异质性。
接着使用AUCell、Ucell、singscore、ssgsea和AddModuleScore算法，并结合相关性分析，确定了影响脑出血后高OS的关键基因。此外，作者使用了四种机器学习算法，即极限梯度提升、Boruta、随机森林和最小绝对收缩和选择算子来识别最优特征基因，发现ANXA2和COTL1与ICH后的高OS密切相关。最后作者运用动物模型验证以上结果，发现脑出血后OS表达增加。此外，ANXA2和COTL1蛋白表达显著升高，并与小胶质细胞共定位。Pearson相关系数分析显示ANXA2和COTL1均与OS显著相关。
关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型
1 单个疾病WGCNA+PPI分析筛选hub基因
2 单个疾病结合免疫浸润，热点基因集，机器学习算法等
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析
4 基于分型的非肿瘤生信分析
5 单细胞结合普通转录组生信分析
目前非肿瘤生信发文的门槛较低，有需要的朋友欢迎交流
研究流程：
研究结果：
利用scRNA-seq数据集分析ICH后OS相关特征的复杂性。
作者收集了807个OS相关基因，并对单细胞数据进行GSVA分析，评估在ICH中OS的影响，其观察到，与正常脑组织相比，ICH脑组织表现出更高的OS活性(图2A)。为了探索具有高OS活性的细胞类别，作者从scRNA-seq数据集中筛选了37,818个高质量的细胞用于进一步分析(补充图)。PCA结果表明，在所有分析样本中，细胞分布相对稳定，对批次效应的敏感性较低(图2B)。UMAP结果表明，所有细胞被细致地划分为27个簇(图2C)。细胞注释结果表明，作者获得了8种不同的细胞类型，包括T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、粒细胞和神经元(图2D-E)。基于8种不同细胞类型的GO分析富集的相关通路则提供了对这些细胞类型的更深入的理解(图2F)。
为了研究脑出血后单细胞水平的OS活性，作者使用AUCell, Ucell, singscore, ssgsea和AddModuleScore算法来计算每个细胞的OS活性。这些算法的结果均表明，脑出血后，OS活性在不同的细胞层中表现出异质性。单核细胞中的OS活性最高，而T细胞、NK细胞和B细胞的活性相对较低(图3A-B)。UMAP图也显示单核细胞和巨噬细胞上的OS活性高(图3C)。根据总OS活性的中位数，将所有细胞分为高OS细胞和低OS细胞(图3D)。相关性研究结果显示，有124个基因与OS密切相关(图3E)。作者对高OS活性和低OS活性之间的OS上调基因进行了DEG(图3F)。DEG结果共鉴定出374个基因参与了OS活性的上调(补充表5)。最终，共有93个基因与参与上调OS活性的DEG同时存在于相关分析中(图3G)。 此外作者还对筛选出的93个基因进行了GO分析和PPI网络分析（图4，未放置图）
机器学习算法筛选最优基因
作者使用4种不同的机器学习算法用于识别93个基因中的最优特征基因。利用xGBoost算法，其得到了5个关键基因(图5A)；通过Boruta算法迭代500次后，其确定了11个关键基因(图5B)；利用RF算法后，作者识别出23个重要性评分> 0的关键基因(图5C)；此外，使用LASSO算法确定了6个关键基因作为OS的诊断标志物(图5D)。最后，将四种机器学习算法识别的基因合并后，其最终确定了两种最优特征基因——ANXA2和COTL1(图5E)。为了评估分析的准确性，作者也在批量水平上评估了两个基因的表达差异。结果表明，与非脑出血组相比，脑出血组中ANXA2和COTL1的表达显著升高(图5F-G)。通过ROC曲线评价2个特征基因的诊断价值。ANXA2的ROC曲线下面积为1.0(图5H)，COTL1为0.964(图5I)。
单细胞水平验证最优基因
ANXA2和COTL1在整体水平的单核细胞谱系中表现出较高的丰度(图6A)。为了进一步确定这两个最优特征基因所影响的特定细胞类型，作者在单细胞水平进行了验证。点图结果显示，ANXA2和COTL1在单核细胞中高表达，而在T细胞、NK细胞和B细胞中的表达相对较低(图6B)。ANXA2和COTL1的小提琴图结果表明，单核细胞中基因表达升高(图6C)。此外，UMAP的结果也表明ANXA2和COTL1主要在单核细胞中表达(图6D-F)。此外，作者还对大数据集的血肿脑组织数据进行了GSEA富集分析（补充图）。
轨迹分析和细胞间相互作用分析
接着，作者将单核细胞分为ANXA2 +单核细胞组和ANXA2-单核细胞组，COTL1 +单核细胞组和COTL1-单核细胞组，利用Monocle2进行轨迹分析，以评估单核细胞的转录异质性。随着准时间过程的展开，ANXA2 +单核细胞和COTL1 +单核细胞的比例同步分化，cluster0亚型所占比例逐渐降低，而cluster1和cluster2亚型所占比例逐渐升高(图7A)。图7B显示了伪时间轨迹分析中ANXA2和COTL1的相对表达量。
细胞通讯结果显示了ANXA2 +单核细胞与COTL1 +单核细胞以及其他细胞类型之间的细胞通讯数量和强度(图7C-E)。在图7F中，热图结果表明ANXA2 +单核细胞和COTL1 +单核细胞表现出更高的沟通概率，尤其是在半乳糖凝集素相关通路中，差异最显著。图7G-H显示了不同细胞类型与ANXA2和COTL1标记的单核细胞之间的配体-受体相互作用。结果发现，ANXA2 +单核细胞通过LGALS9-CD45、LGALS9-CD44和MIF-(CD74 + CXCR4)受体配体对与其他细胞类型结合。同样，COTL1 +单核细胞通过LGALS9-CD45、LGALS9-CD44和MIF- (CD74 + CXCR4)受体配体与其他细胞建立联系。此外，巨噬细胞和神经元也可以通过各种配体-受体对与ANXA2 +单核细胞和COTL1 +单核细胞进行交流。ANXA2和COTL1在单核细胞中的代谢通路分析结果表明，与ANXA2-单核细胞组和COTL1-单核细胞组相比，ANXA2 +单核细胞组和COTL1 +单核细胞组表现出更丰富的代谢通路
动物实验验证最优基因
作者构建了ICH的大鼠模型，ICH后，血肿周围组织中MDA的表达显著增加，同时伴有T-SOD的表达水平降低(图8A-B)，提示脑出血后脑组织中OS活性增高。为了评估ANXA2和COTL1在脑出血大鼠组织中的表达，作者进行了蛋白质印迹法和免疫荧光实验。western blot结果显示，与假手术组相比，脑出血后ANXA2和COTL1的蛋白表达增加(图8C-D)。免疫荧光结果显示，ICH后，外周血进入脑组织，激活小胶质细胞，ANXA2表达上调，主要定位于周围血肿组织的小胶质细胞(图8E)。此外，作者还观察到脑出血后小胶质细胞广泛表达COTL1(图8F)。Pearson相关系数显示ANXA2和COTL1的表达与OS显著相关，具有高度的一致性(图8G)。以上表明ANXA2和COTL1参与了ICH后观察到的高OS过程。
研究总结：
在这项研究中，作者在单细胞水平上重新定义了ICH后上调OS的基因集。此外，其将基因集与大量数据整合，通过机器学习算法识别ANXA2和COTL1两个特征基因。在实验方面，作者构建了了ICH大鼠模型，评估了其在发生ICH后的OS活性， 并检测了最优基因ANXA2和COTL1的表达，评估了两个基因与OS活性的相关性，最后作者还通过免疫荧光发现了ICH大鼠脑组织中存在单核细胞浸润大脑，以及两个基因胶质细胞中的高表达。上述结果可能对未来更好地理解ICH后的OS有重要意义。
