细胞培养的步骤：
1、细胞复苏
将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。将融化的细胞移入离心管中，加入37℃预热的DMEM完全培养基中（其中胎牛血清约为10%），轻轻吹匀，离心，500g离心2min，弃上清液。
加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。加入DMEM完全培养基，轻轻吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培养皿/瓶中，在含5% CO2的细胞培养箱中培养。
2、细胞传代
当细胞密度达到80%~90%（过早产量不足，过晚细胞状态不佳，1:2至1:10以上的比率传代培养，一般1:3至1:5细胞一代，即从细胞接种到分离再培养的一段时间，非细胞有丝分裂次数）时，去掉完全培养基，用1X PBS清洗2次。
加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以盖住细胞，消化温度是37℃。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度）进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。
加入适量DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。
加入DMEM完全培养基，轻轻吹打混匀，吸取10微升进行计数，然后按照所需细胞量在含5% CO2的细胞培养箱继续培养。
3、细胞冻存
当细胞密度达到80%~90%时，去掉完全培养基，用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。加入DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。加入lml冻存液（90%胎牛血清，10%DMSO。 一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护细胞），放入冻存管内（管内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入4℃冰箱中冻存30min，然后放入-20℃冰箱中冻存30min，再置于-80℃冰箱内过夜。
第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。
细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。
注意事项：
一、复苏
1、复苏细胞时，将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。
2、 已解冻的细胞避免长时间常温存放，需尽快离心去除DMSO；
3、刚复苏的细胞贴壁尚不牢固，24h内不要频繁观察和换液；
二、消化
1、加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以盖住细胞，消化温度是37℃。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度），不同细胞消化时间有所不同。
2、吹打细胞需要轻柔，以免对细胞产生机械性损伤。
3、PBS润洗细胞时，从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入PBS，避免冲刷到细胞层。
三、细胞冻存
1、选取对数生长期的细胞进行冻存，此时细胞状态比较好；
2、细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。
四、无菌操作
1、使用物品用75%酒精消毒后放入生物安全柜。
2、手尽量不要经过敞开的培养基上方。
五、培养条件
1、将培养瓶放入培养箱，并将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换（如使用透气性瓶盖，则无需旋松瓶盖）。
