1 所需试剂、耗材、设备:
1.1 溶胶液、磁珠、80%酒精、1.5琼脂糖胶(已加核酸染料)、marker2000、溴酚蓝、TAE
1.2 96孔深孔板、封板膜、
1.3 高速离心机、水浴锅、磁力架,涡旋振荡器、电泳仪、电泳槽、紫外切胶台
2 实验步骤:
2.1上样检测
2.1.1 整理样本,将样本名称、编号、条带大小顺序录入《质粒样品制备情况记录表》
2.1.2 每孔PCR产物加入6ul溴酚蓝
2.1.3 取25ulPCR、溴酚蓝混合液上样至琼脂糖胶孔,每条胶预留至少一个孔位上样Marker2000
2.1.4 电泳仪400V电泳15min(可根据电泳仪实际功率调整)
2.1.5 将电泳后的胶块转移至紫外切胶台或紫外成像系统拍照保存
2.2切胶溶胶
2.2.1 根据PCR样本标注条带大小,切取对应的条带,按照样本顺序放入96深孔板(注意样本顺序,千万不要放错孔位)
2.2.2 观察条带亮度和大小,预估样本浓度,判断后面单引物扩增模板量,标注在《质粒样品制备情况记录表》
2.2.3 切完胶块后,每孔加入550ul溶胶液,60℃水浴25min,期间震荡混匀一次(单管回收水浴12min)
2.3产物回收
2.3.1 溶胶完成后,每孔加入25ul磁珠,封膜,震荡10s静置1min重复6次以上
2.3.2 将96深孔板放置在96磁力架上静置2min,待上清清澈后弃上清
2.3.3 每孔加入450ul 80%酒精,震荡20s,静置1min
2.3.4 将96深孔板放置在96磁力架上静置2min,待上清清澈后弃上清。(重复2.3.3-2.3.4一次)
2.3.5 将96深孔板放入烘箱68℃烘干15min
2.3.6 取出96深孔板,每孔加入40ul蒸馏水震,振荡器震荡30s,静置2min,离心至1000r/min。
2.3.7 将96深孔板放置在磁力架上吸附1min