-前记

想学新东西，就要大量总结相似问题。因此，应该对所有做的实验先做一遍总结。2020.12.3记

实验目的

获得目的基因的PCR产物，用于后续的连接反应

实验要求

提前准备：称量空的离心管；干净的滤纸，干净的刀片，干净的2.0mlEP管2个，1.5mlEP管1个，废旧柱子1个配平用，普通水一管配平用；打开金属浴，设置好56-60℃，放上无菌dd水，start；枪，枪头，桌面垃圾桶，计时器，剪刀。

胶回收应该换全新的电泳液去做凝胶电泳；小槽子要用80V的电压去跑；制胶要在0.7%的浓度；要视自己样的体积来选取梳子，因为小孔要尽量加样加满，充分利用胶。

切胶尽量切小，但不能切掉条带，提高回收效率，就切四刀，干净利落；切胶后要用干净滤纸吸去水分；可用枪头捣碎胶块，加速溶解。-已加入练习清单

金属浴要提前打开，提前放入dd水；加入好溶胶液后的离心管放入金属浴后，每2-3min轻轻旋转/用手指轻弹，千万不要用漩涡震荡仪去震荡

在金属浴加热过后的溶胶液需要冷却到室温才可以加至吸附柱中

加入柱子的DD应留一部分空余，不要溢出来；若用于胶回收的液体过多，应分批次加入同一个吸附柱离心，不能再启用新吸附柱。Q水下去后，柱子里面是真空的吗？

漂洗液WB需要事先加入无水乙醇，特别注意要在无菌条件下用灭过菌的50ml的离心管去加，这样做是引物要尽可能防止过程的污染

最后一步，要在把30微升的无菌水打到吸附膜的中央，千万不可偏离。-已加入练习清单

胶回收后的液体，有两种方法探究浓度，一是去仪器那里测浓度，二是与maker跑胶，肉眼比对亮度来估计浓度，一定要记好加了多少的样多少的maker。

关于去除乙醇时的空转是否打开盖子？？？不理解。为什么有些操作就要在通风橱里面通风。？？？

Check-list

 梳子TAE制胶跑胶

 六孔红色梳子30ml TAE制小胶点50ul满当了，将溢出

 三孔等距白色梳子30ml TAE制小胶跑50ul以上

胶回收后要跑胶验证，一来肉眼观看浓度，二来查看是否有隐形带未分开的带。

单独一个gene+切比较好

用水洗脱，DNA片段应该保存在一20℃。

[实验解析]

(1) 在实验过程中需要注意:

①为了保证回收效果，电泳时使用新鲜电泳缓冲液。

②切胶时胶块尽量小，溶胶时确保胶块完全溶化。

③为避免紫外照射造成DNA损伤，影响下游连接反应，在切胶时尽量缩短紫外照射时间。

(2)多数回收试剂盒对于过小或过大的DNA片段的回收效率较低。因此，在回收过小或过大的 DNA时（尤其是目的基因片段过小)，需要注意查看说明书中的 DNA片段大小范围。

(3）有些酶切产物酶切后仍为单一的 DNA片段，不需要进行跑胶回收，如目的基因PCR产物酶切后，往往只切除掉了几个保护碱基。这种情况下，直接向酶切产物中加入3倍体积的溶胶液GSB，按照后续步骤回收即可。若酶切体系小于100ul，建议先用ddH,O将体系补足至100ul。

操作提纲

1.提前准备

查看是否有人在用电泳仪，TAE是否够，打开金属浴设定60℃，将EB/水预热

拿大盘子准备：计时器、枪（1000 & 100）、枪头（大 & 中）、离心管（2ml&1.5ml提几个拿几套）练习用的离心管、滤纸、马克笔、配平用的小烧杯水、琼脂糖凝胶纯化试剂盒

2.简要步骤（艾德莱生物）

简略版

天平放空的2ml EP管，去皮

.紫外灯下切胶，放滤纸吸水2秒立马放入空2ml EP管，称量，称量*3即为要加入的DD体积（ml）

金属浴 56℃ 10min，每2-3分钟手指轻弹一次帮助加速。别转，到处都是。

趁这时间做平衡液预处理：+100ul平衡液到柱子 13000r 1min 弃废液

DD冷却至室温加入柱子，放1min（趁这时间搞配平），12000r 30-60s 弃废液。如果总体积超过750ul，分两次同一柱子离心

+600ul WB, 12000r 30s 弃废液

重复+600ul WB, 12000r 30s 弃废液

空转 12000r 2min

拿柱子放进干净1.5ml EP 管，拿100枪和枪头去金属浴跟前，+dd水 30ul or +EB 30ul，放置5min，12000r 1min

标记好 胶回收 名字 几月几号 浓度

用水洗脱，DNA片段应该保存在一20℃

3.安全注意事项

EB致癌物

4.可能出现的现象

我遇到的问题

用WB洗一次不行，阿鲍跑出来是弯的。？？？

可能遇到的问题的解决方案

5.方法/心得/技巧

1.  提高胶回收量的办法：

1)  增加电泳时的上样量。

2)  电泳缓冲液用新鲜配制的。

3)  切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。

4)  把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。

5)  溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。

6)  胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。

7)  加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。

8)  最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。

9)  可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。

10)  将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。

2.  几种PCR 产物回收的详方法和步骤

1)  普通胶回收

如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。另外好像还有冷冻法，没作过，不是很清楚。

2)  从低熔点凝胶回收DNA

纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。

3)  扩增特异性好的PCR回收

如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。

3.  不需胶回收就可直接连接的方法

1)  低温冷冻析出法

跑电泳时用低熔点的agarose胶，跑到一定时候，将目的条带所在的那一段胶切下，尽量切干净，让核酸直接暴露在胶的表面，并且，把底下没有脱氧核酸的那点胶也尽量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在负75度冰箱中10－30分钟，接着1，300rpm离心5－10分钟，取10ul上清，加入连接体系中。将其余的液体也吸出，储存在另一个管子中，做好标记，放在－20度备用。

2)  酶切后的直接连接

在你酶切后可以直接的加入连接酶和另外的片断进行连接是可以筛选出连接好的片断的

另外注意

1.琼脂糖对回收率有一定影响，如果琼脂糖较多，可以增加溶胶液，保证体系盐浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中（如果用柱子的话）。对于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%异丙醇。

2.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。当然你要将100bp在胶中位置定好切下。已标记的探针用X片，未标记的用EB。

3.选用回收效率较高的柱子，比如进口的Qiaquick spin column。

4.参照分子克隆用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。

4.DNA小片段的纯化回收

小于100bp的片断通常在电泳时就比较难观察分辨，需要用分辨率很高的琼脂糖或者丙烯酰胺凝胶。比如Cambrex的NuSieve 3:1或者GTG，或者是大名鼎鼎的MetaPhor琼脂糖。所以实际上对于小片断，可以分为两种情况：

一个是真的要回收电泳中特别小的片断，这种情况我们前面有提到，比如Qiagen MinElute系列可以回收70bp以上的片断；而QIAEX纯化介质可以回收40bp以上的小片断，可以根据情况选择。

另外一种情况是要去除一些小片断或者是核苷酸、标记物、或者是一些酶切碎片，或者去掉接头（Linker/Adeptor）或者什么的。其实这时已经不需要用电泳来分别，也就算不上胶回收的范围，不过既然提到了就顺手写写。

PCR产物回收试剂盒实际上也是一种除去小片断的试剂盒，通常回收范围是100bp到10KB之间，也就是说将小于100bp（或者70bp）的引物或者引物二聚体连同其他杂质一同去除，操作简单，只需要将PCR产物加入过滤纯化柱中离心，清洗一次，洗脱就可以了，5分钟搞定，回收率高达95%。

PCR后需要酶切时，以前常常为省略跑胶纯化的步骤，要在PCR产物中直接酶切，往往导致一些酶切问题，如今用这种PCR产物纯化试剂盒就不用电泳，5分钟OK了。用不着冒险直接酶切――万一酶切有问题多麻烦呀。

通常同一个品牌的PCR产纯化试剂盒和胶回收试剂盒的柱子是同样的柱子，区别是胶回收试剂盒多一个溶胶液。所以，你可以用胶回收试剂盒做PCR产物纯化，溶胶液照加可也，调pH和盐浓度而已。

如果需要纯化寡核苷酸或者引物，Qiagen的QIAquick Nucleotide Removal Kit是一个好选择。可以用于纯化17-40mer的寡核苷酸小分子，以及40bp-10kb的DNA 。用于纯化标记反应是不错的选择，方法和PCR产物回收试剂盒是一样的，很方便。

除了这种膜吸附的柱子，还有一种凝胶过滤原理的柱子也可以用于分段收集不同大小的产物，那个在建库等实验中用的比较多，也有用于纯化标记反应中的未标记分子或者核苷酸的。

很小的DNA 片断常常会用PAGE胶电泳。

PAGE胶好像还没有很好的溶解方法，除了我们前面提到的电洗脱，Qiagen还提供一些私人方法，在应急的时候可以尝试。将切割下来的PAGE条带冲洗后加入指管中，加入2倍体积的分散缓冲液（0.5M醋酸胺、10mM的醋酸镁，1mM EDTA， 0.1%SDS，pH8.0）50度保温30分钟，离心取上清，避免混入碎胶，加入3倍体积的溶胶液，后面步骤一样。这样也可以回收PAGE胶里的片断。

技术原理

详细版

下面步骤来自实验室的北京艾莱德的琼脂糖凝胶回收试剂盒，不同试剂盒步骤不一样。说明书：http://www.aidlab.cn/up_product/big/2013-2-22-1449764178.pdf

关于平衡液

介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。一般刚买来2,3个月的新硅胶柱子不需要使用平衡液。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。100ul平衡液加入柱子中，13000r 1min 弃废液，即可预处理完毕。

提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

1.在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。

注：切胶回收时，紫外灯观察对DNA片段有损坏作用，应该尽可能使用能量低的长波紫外线，并且尽可能的缩短紫外线下处理的时间。

2.将切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，称重。

先称一个空1.5ml离心管重量，然后放入凝胶块后再称一次，两次重量相减，得到凝胶的重量。

3.加3倍体积溶胶液DD。

如果凝胶重为100mg，其体积可视为100ul，则加入300pul溶胶液。如果凝胶浓度大于2%，应加入6倍体积溶胶液。

4.56℃水浴放置10分钟（或直至胶完全溶解)。每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。

5.可选,一般不需要:每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀。

有时候加入异丙醇可以提高回收率，加入后不要离心。回收大于4Kb的片段时，不加入异丙醇，加入有时反而可能降低回收效率。

6.将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)，室温放置1分钟，

12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。

如果总体积超过750ul，可分两次将溶液加入同一个吸附柱EC中。

7.加入700ul漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm离心30

秒，弃掉废液。

8.加入500ul漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。

9.将吸附柱EC放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂

洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10.取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50ul洗脱缓

冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于25ul，体积过小降低DNA洗脱效率，减少产量。

注：洗脱液EB不含有整合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，DNA片段应该保存在一20℃。DNA片段如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（ 10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0>，但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。