研究背景：
颞下颌关节（TMJ）关节炎是第二大常见肌肉骨骼疼痛疾病，以持续性颌面部疼痛和功能障碍严重影响患者生活质量。该疾病研究受限于其独特的神经嵴起源纤维软骨结构（含I/II型胶原）及组织获取困难，而传统单细胞测序因破坏空间结构难以解析稀有细胞亚群和局部互作，空间转录组学在矿化关节中的应用又面临RNA保持和脱钙等技术瓶颈，故在单细胞分辨率下阐明TMJ关节炎的细胞空间组织架构及其与疼痛的因果关系，已成为该领域亟待解决的关键科学问题。
针对上述问题，南加州大学Chen Jianfu教授团队创新性地将seqFISH（sequential Fluorescence In Situ Hybridization）空间转录组学技术应用于硬组织矿化关节研究。该团队通过96个基因探针的单细胞分辨率空间映射，系统构建了正常与炎性关节炎TMJ的细胞图谱，首次揭示了滑膜成纤维细胞-免疫细胞微环境通过Igf1-Il33轴驱动关节炎进展与疼痛的分子机制，并通过基因敲除模型验证了该轴线的治疗靶点潜力。该研究于2026年1月7日以《Spatial Transcriptomics of TMJ Reveals a Remodeling Fibroblast-Immune Microenvironment Driving Arthritis Pain》为题发表于《Advanced Science》（DOI: 10.1002/advs.202419816）。
（1）seqFISH空间转录组技术建立与正常TMJ细胞解剖图谱解析
基于前期单细胞转录组数据筛选96个标记基因（成纤维细胞：Prg4、Thy1、Ptn；纤维软骨细胞：Col1a1、Sox9；巨噬细胞：C1qa、Cd68；骨软骨细胞：Acan、Col2a1；内皮细胞：Pecam1、Emcn等），通过探针特异性设计实现单细胞分辨率空间转录组检测。质控后保留45,036个细胞，平均每个细胞检测到134±185个转录本和20±13个基因。无监督聚类结合解剖定位鉴定出颞下颌关节主要细胞群体及亚型，包括纤维软骨细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、骨骼细胞、内皮细胞、脂肪细胞、施万细胞和肌肉细胞，并基于标记基因与空间位置识别出Thy1+/Ptn+纤维软骨祖细胞及Dpp4+肌腱韧带祖细胞等潜在干细胞群体。
图1. seqFISH解析成年小鼠颞下颌关节（TMJ）主要细胞类型空间分布。（A）基于前期单细胞转录组数据筛选探针的实验设计示意图。（B）2月龄正常小鼠TMJ矢状切面代表性seqFISH图像显示各细胞类型空间分布。（C）髁突软骨区域Col1a1（绿色）、Sox9（红色）、Col2a1（品红）与Col10a1（蓝色）共表达特征，标识表层区（SZ）、多形区（PZ）、软骨母细胞区（CZ）及肥大区（HZ）。比例尺：60 μm。（D）图C单通道拆分。比例尺：60 μm。（E）骨骼细胞中Ptn（绿色）、Runx2（红色）、Lepr（品红）与Thy1（蓝色）表达。比例尺：300 μm。（F）图E单通道拆分。比例尺：300 μm。（G）肌腱及韧带细胞Tnmd（绿色）、Dpp4（红色）、Scx（品红）与Tnc（蓝色）表达。比例尺：300 μm。（H）图G单通道拆分。比例尺：300 μm。
（2）seqFISH空间转录组技术建立与正常TMJ细胞解剖图谱解析
基于前期单细胞转录组数据筛选96个细胞标记基因（涵盖成纤维细胞标志物Prg4、Thy1、Ptn，纤维软骨细胞标志物Col1a1、Sox9，巨噬细胞标志物C1qa、Cd68，骨软骨细胞标志物Acan、Col2a1，内皮细胞标志物Pecam1、Emcn等），利用特异性探针设计建立单细胞分辨率空间转录组分析方法。质控后共保留45,036个细胞，平均每个细胞检测到134±185个转录本和20±13个基因。无监督聚类结合解剖定位鉴定出颞下颌关节主要细胞群体及亚型，包括纤维软骨细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、骨骼细胞、内皮细胞、脂肪细胞、施万细胞和肌肉细胞；进一步基于标记基因表达与空间位置特征，识别出Thy1+/Ptn+纤维软骨祖细胞及Dpp4+肌腱韧带祖细胞等潜在干细胞群体。
图2. seqFISH图谱揭示小鼠颞下颌关节（TMJ）炎性关节炎细胞类型变化。（A）实验设计示意图。（B）对照组与完全弗氏佐剂（CFA）诱导关节炎组TMJ细胞类型空间定位及比例统计。（C）两组TMJ各细胞类型空间分布特征。（D）内皮细胞Pecam1（白色）、Emcn（蓝色）、Vcam1（红色）与Icam1（绿色）表达模式。比例尺：300 μm。（E）淋巴管内皮细胞Lyve1（蓝色）、Flt4（绿色）、Prox1（红色）与Ptx3（品红）表达模式。比例尺：300 μm。（F）细胞外基质Col1a1（红色）与Tnc（绿色）表达模式。比例尺：300 μm。（G）两组TMJ上区Masson三色染色及胶原面积分数定量分析。比例尺：100 μm。
（3）滑膜成纤维细胞-巨噬细胞互作微环境的细胞邻域重构
seqFISH空间定位结果显示，正常颞下颌关节巨噬细胞主要分布于屏障区及滑膜下层，而完全弗氏佐剂（CFA）诱导的关节炎状态下，巨噬细胞与成纤维细胞在整个滑膜组织内显著扩增并呈现高度混杂分布。基于Squidpy算法的度中心性分析表明，正常状态下巨噬细胞、肌肉细胞和内皮细胞中心性最高；关节炎状态下巨噬细胞、成纤维细胞和肥大细胞成为细胞互作网络核心，其中成纤维细胞中心性由0.1增至0.5，增幅最为显著，表明二者空间互作明显增强。基因表达分析显示，关节炎巨噬细胞显著上调促炎标志物Tnfα、Sema4d和Cd68，滑膜成纤维细胞（Prg4+衬里层、Thy1+衬里下层）扩增并高表达Il33、Ccl2和Tnfα。人颞下颌关节关节炎滑膜活检标本免疫荧光染色证实上述发现：IBA1+CD68+炎症性巨噬细胞与PDGFRα+成纤维细胞呈空间邻近分布，且PDGFRα+细胞高表达IL-33。
图3. 关节炎颞下颌关节滑膜微环境重塑及巨噬细胞-成纤维细胞互作。（A）对照组与完全弗氏佐剂（CFA）诱导关节炎组巨噬细胞（品红）与成纤维细胞（黄色）空间定位。（B）两组细胞类型度中心性分析。巨噬细胞在两种条件下中心性最高，关节炎组成纤维细胞中心性显著增加（仅次于巨噬细胞）。（C）巨噬细胞C1qa（白色）、Cd68（红色）、Tnfα（绿色）与Sema4d（蓝色）表达模式。比例尺：300 μm。（D）衬里层Prg4+（红色）与衬下层Thy1+（绿色）成纤维细胞分布。比例尺：300 μm。（E）两组成纤维细胞Thy1（白色）、Tnfα（绿色）、Ccl2（蓝色）与Il33（红色）表达。比例尺：300 μm。（F）人颞下颌关节滑膜活检取材示意图。（G-I）人滑膜免疫荧光染色：（G）IBA1（绿色）、CD68（红色）、IGF1（白色）；（H）PDGFRα（绿色）、CD68（红色）；（I）PDGFRα（绿色）、IL-33（红色）。DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺：50 μm。
（4）巨噬细胞特异性Igf1缺失促进炎症与成纤维细胞扩增
基于空间转录组发现IGF1主要表达于巨噬细胞，研究构建了Cx3cr1CreERT2;Igf1fl/fl巨噬细胞特异性条件敲除（cKO）小鼠。连续他莫昔芬诱导后建立CFA关节炎模型，结果显示巨噬细胞Igf1缺失导致Cx3cr1-YFP+;Il1b+促炎巨噬细胞比例显著增加（约3倍），而CD206+抗炎巨噬细胞显著减少。同时，PDGFRα+成纤维细胞在前、后、上关节区均显著扩增，且伴随TUBB3+神经纤维密度增加，表明Igf1缺失破坏了巨噬细胞活化平衡，促进成纤维细胞激活和异常神经支配。
图4. 巨噬细胞Igf1缺失驱动炎症及成纤维细胞扩增。（A）前区颞下颌关节切片Igf1（红色）RNAscope与Cx3cr1-YFP（绿色）免疫荧光染色。（B）实验设计示意图。（C）后区或上区Il1b（红色）RNAscope与Cx3cr1-YFP（绿色）、Iba1（白色）免疫荧光染色，DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺：50 μm。（D）Cx3cr1-YFP+;Il1b+面积分数定量分析。（E）Cx3cr1-YFP（绿色）与CD206（红色）免疫荧光染色，DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺：50 μm。（F）CD206+面积分数定量。（G）PDGFRα（绿色）与TUBB3（红色）免疫荧光染色，DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺：50 μm。（H）PDGFRα+;TUBB3+面积分数定量。数据以均值±SEM表示，Student's t检验，n≥3，*p<0.05，**p<0.01。
（5）IGF1蛋白关节腔注射缓解TMJ关节炎颅面疼痛
可降解注射型水凝胶（DISH Gel）负载重组IGF1蛋白，于完全弗氏佐剂（CFA）诱导前行单侧关节腔注射以实现持续缓释。通过咬合力测试及Von Frey机械痛觉测试评估颅面疼痛行为。CFA诱导使咬合力较基线下降约60%，IGF1-水凝胶治疗组自第3天起显著改善，第7天恢复至接近正常水平。Von Frey测试显示CFA组头部退缩阈值显著降低（痛觉过敏），IGF1治疗显著提高痛阈且效果优于单独水凝胶对照，表明局部IGF1补充可有效缓解颞下颌关节功能障碍及疼痛相关行为。
图5. 关节腔注射IGF1蛋白联合水凝胶缓解颞下颌关节关节炎小鼠颅面疼痛。野生型小鼠经溶媒或重组IGF1蛋白混合水凝胶预处理后行PBS或完全弗氏佐剂（CFA）注射，并在连续时间点进行疼痛行为学评估（A），采用咬合力测试（B）与Von Frey机械痛觉测试（D）量化颅面功能及痛觉过敏程度。IGF1-水凝胶治疗组相对咬合力值（C）与头部退缩阈值（E）均较CFA对照组显著改善，其中PBS组n=5、CFA组n=5、水凝胶+CFA组n=6、水凝胶+IGF1+CFA组n=10。所有数据以均值±SEM表示，双因素方差分析结合Tukey事后检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
（6）Igf1-Il33细胞互作轴的双向调控机制解析
骨髓来源巨噬细胞（BMDM）极化实验显示，M1（促炎）巨噬细胞Igf1表达较M2（抗炎）降低约75%，其条件培养基（M1-CM）刺激使成纤维细胞Il33表达上调约3倍，表明低Igf1表达的炎症性巨噬细胞促进成纤维细胞Il33表达。利用PdgfraCreERT2;Il33fl/fl小鼠特异性敲除成纤维细胞Il33后，完全弗氏佐剂（CFA）诱导的关节炎模型中，突变体小鼠前、后、上关节区Iba1+巨噬细胞和Ly6b+中性粒细胞中Il1b表达显著降低，证实成纤维细胞来源的IL-33通过正反馈维持炎症微环境，形成"巨噬细胞Igf1降低→成纤维细胞Il33升高→免疫细胞炎症增强"的恶性循环。
图6. 炎症性巨噬细胞通过调控成纤维细胞Il33表达影响炎症微环境。（A）M1/M2巨噬细胞条件培养基与成纤维细胞共培养体系示意图。（B）巨噬细胞Igf1 mRNA表达水平检测，M1型较M2型显著降低。（C）成纤维细胞Il33 mRNA表达水平检测，M1-CM刺激组较M2-CM组显著升高。（D）上区颞下颌关节切片IL-33（绿色）免疫荧光染色，DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺：100 μm。（E）IL-33阳性面积分数定量分析。（F）野生型与PdgfraCreERT2;Il33fl/fl条件性敲除小鼠实验设计示意图。（G,H）不同区域Il1b（红色）RNAscope与Ly6b（白色）、Iba1（绿色）免疫荧光共染色，DAPI（蓝色）标记细胞核；H图为G图框选区域放大（20×物镜）。比例尺：100 μm。（I-K）前区、后区、上区Il1b+;Ly6b+与Il1b+;Iba1+面积分数定量。数据以均值±SEM表示，Student's t检验，n=3–4，*p<0.05，**p<0.01。
（7）靶向成纤维细胞Il33的遗传学治疗验证与疼痛缓解
成纤维细胞Il33敲除使关节炎颞下颌关节中PDGFRα+成纤维细胞数量降低50-70%，TUBB3+神经纤维密度在前、后、上区域均显著减少，提示IL-33参与维持异常神经支配。疼痛行为学检测显示，PBS对照条件下野生型与Il33条件性敲除小鼠基线无差异；完全弗氏佐剂（CFA）关节炎状态下，Il33条件性敲除小鼠第7天咬合力恢复约20%（对照组下降50%），头部退缩阈值显著改善，痛觉敏感性降低。遗传靶向成纤维细胞Il33可阻断纤维化-神经支配-疼痛恶性循环，为颞下颌关节关节炎提供精准干预靶点。
图7. 成纤维细胞Il33缺失减轻颞下颌关节神经支配及疼痛症状。（A,B）颞下颌关节矢状切片TUBB3（红色）与PDGFRα（绿色）免疫荧光共聚焦成像，DAPI（蓝色）标记细胞核；B图为A图框选区域放大（20×物镜）。比例尺：100 μm。（C-E）前区、后区、上区TUBB3+;PDGFRα+神经-成纤维细胞复合体面积定量分析。（F）野生型与PdgfraCreERT2;Il33fl/fl条件性敲除小鼠疼痛行为学实验设计示意图。（G）相对咬合力值定量，对照-PBS组n=5、MUT-PBS组n=5、对照-CFA组n=7、MUT-CFA组n=7。（H）头部退缩阈值定量，样本量同G。数据以均值±SEM表示，双因素方差分析结合Tukey事后检验，*p<0.05，**p<0.01。
「 研究小结 」
本研究通过seqFISH空间转录组学首次在单细胞分辨率下绘制了TMJ关节炎的时空演变图谱，突破了传统单细胞测序缺乏空间信息的局限。研究不仅识别了反应性微静脉（REVs）、炎症性淋巴管内皮和纤维化基质等关键微环境组分，更重要的是揭示了巨噬细胞-成纤维细胞通过Igf1-Il33轴线形成正反馈环路驱动疼痛的新机制。该轴线表现为：炎症状态下巨噬细胞Igf1表达降低，解除对成纤维细胞的抑制，导致成纤维细胞Il33上调；而Il33反过来进一步促进巨噬细胞炎症活化和神经支配，形成恶性循环。通过基因敲除（巨噬细胞Igf1 cKO、成纤维细胞Il33 cKO）和蛋白补充（IGF1水凝胶递送）的功能验证，研究证实了该轴线的可靶向性，提出了"IGF1激活+IL-33阻断"的双重干预策略，为打破TMJ关节炎的纤维化-炎症-疼痛恶性循环提供了精准治疗新思路。
